杨树Elp基因影响ncm5U生物合成和参与干旱耐受的功能分析

Transfer RNA (tRNA) contains various modified nucleosides, which can regulate multiple pathways by influencing translation of proteins. Eukaryote-specific modified nucleoside ncm5U (5-carbamoylmethyluridine) is an important tRNA anticodon modification, the biosynthesis of ncm5U is affected by transcriptional Elongator Complex (ELP complex). Recent study suggests that Elongator Complex participates in the regulation network of drought stress tolerance in model plant Arabidopsis thaliana. This project uses Populus spp. as model plant, by combining transcriptomics, modomics and transgenic approaches, to study: (1) the expression profile of Populus Elp genes and their response during drought stress; (2) the molecular mechanism of Populus Elp genes in regulation of drought stress tolerance; (3) the regulation of Populus Elp genes in ncm5U modification; (4) influence of drought stress on tRNA modified nucleosides and expression of Populus tRNA genes. The purpose of this study is for the first time to understand the function of tRNA modified nucleosides in woody plant; to establish tRNA transcriptomic approach in studying Populus tRNA modifications; to obtain transgenic Populus lines with high tolerance to drought stress; to reveal the function and regulation mechanism of Populus Elp genes. Therefore this work can provide new insights into the generation of high-tolerant transgenic plants.

转运RNA （tRNA）富含修饰核苷，修饰核苷通过影响蛋白质翻译参与各种生命过程的调控。真核生物ncm5U是tRNA反密码子上的一种重要核苷修饰，其生物合成受转录延伸复合体的调控。近期研究表明转录延伸复合体在模式植物拟南芥中参与植物干旱耐受的调控。 本项目以杨树为研究对象，通过转录组分析、核苷修饰组分析和转基因等手段，研究（1）杨树转录延伸复合体Elp基因的表达模式及其对干旱胁迫的响应；（2）Elp基因参与杨树耐旱的分子机制；（3）Elp基因影响杨树ncm5U核苷修饰的分子机制；（4）干旱处理造成的杨树tRNA差异表达及其核苷修饰水平的变化。 本项目的成功实施可以使我们首次在木本植物中深入研究tRNA修饰核苷的功能，完善tRNA转录组分析在杨树核苷修饰研究中的应用，获得干旱耐受能力提高的Elp转基因杨树植株，解析杨树Elp基因的功能和调控机理，并尝试为植物抗逆研究提供新的思路。

tRNA上富含修饰核苷，修饰核苷的缺失对植物的生长和逆境生理有一定的调控作用。前期有研究发现，真核生物tRNA上位于反密码子34位的ncm5U核苷修饰与延伸因子复合体成员ELP1-6等密切相关，并且影响拟南芥的抗干旱能力。本项目以杨树为研究对象，根据拟南芥转录延伸因子复合体成员ELP1-6以及KTI11-14等基因序列，找到杨树同源基因并进行转基因杨树的构建，研究ELP等延伸因子复合体成员对ncm5U核苷修饰及干旱耐受的影响。.主要研究结果如下：.1.创建了PtELP1(A+B)RNAi, PtELP2 RNAi, PtELP3(A+B)RNAi, PtELP4 RNAi, PtELP5(A+B)RNAi,PtELP6 RNAi，及PtELP1+2+3 triple RNAi转基因杨树材料；创建了PtELP4ox转基因杨树材料；2. 测定了所有转基因株系的基因自身表达水平，ncm5U核苷修饰水平，3.测定了部分转基因杨树的生长速率，以及干旱生理参数（包括离体叶片失水速率，干旱前后叶片相对含水量，干旱前后叶绿素含量，干旱前后脯氨酸及丙二醛的含量等），测定了部分株系的光合参数；4.验证了PtKTI12A蛋白亚细胞定位结果。.通过本项目研究发现，杨树ELP基因和KTI12基因的下调可以降低tRNA修饰核苷ncm5U的含量，与对照相比，相对核苷丰度的降低从20%-50%不等。根据基因表达水平和核苷丰度计算，得到了居中水平的相关系数，说明杨树延伸因子复合体成员 ELP1-6及KTI12基因和ncm5U修饰核苷的合成具有相关性。.通过对ELP和KTI12 RNAi转基因杨树各种生长和生理参数的测定发现，ELP1-6和KTI12A/B基因下调没有对杨树的生长造成显著影响;干旱胁迫前后叶绿素测定，叶片失水率测定，叶片相对含水量，叶片proline和MDA含量测定等数据显示，KTI12A-21, -31及KTI12B-14，-15等RNAi株系比对照具有更好的抗干旱能力。.综上所述，本研究确立了杨树延伸因子复合体及附属成员Elp1-6,Kti12与修饰核苷ncm5U直接相关，KTI12A及KTI12B基因下调的转基因杨树具有更好的抗干旱能力。后续可通过转录组分析研究哪些基因的表达受到影响，从而从分子机制上更好地阐明为何基因与核苷的下调影响杨树干旱胁迫的耐受力。