烟碱降解手性中间体6-羟基-烟碱的生物合成、安全性与生理功能研究

众所周知吸烟有害健康，其重要原因是烟草中存在特殊成分烟碱（尼古丁）使吸食者成瘾。为减少吸烟危害，"降解烟碱"成了国内外研究的热点。吸食者希望既要保持一定生理功能（劲头），又要显著降低危害，烟碱降解到何种程度是重要问题。申请者筛选到一株可降解烟碱的嗜烟碱节杆菌Z3。在此基础上，作者试图合成烟碱降解手性中间体6-羟基-D/L-烟碱，阐明该手性中间体相对于烟碱的吸食安全性和生理功能。采取分别敲除该菌携带的 6-羟基-D/L-烟碱氧化酶基因方法，研究合成6-羟基-D/L烟碱的条件，分离纯化手性产物，进行Ames实验、小鼠急性毒性试验和模拟吸烟条件900℃热裂解成分分析，评价其安全性；采用卷烟感官国家标准GB5606-2005评价其生理功能。本研究为科学降解烟碱，开发烟碱降解微生物细胞转化系统，为建立绿色生物化工新技术打下坚实的理论基础，具有重要的社会意义和经济价值。

摘要：众所周知吸烟有害健康，其重要原因是烟草中存在特殊成分烟碱（尼古丁）使吸食者成瘾。为减少吸烟危害，“降解烟碱”成了国内外研究的热点。吸食者希望既要保持一定生理功能（劲头），又要显著降低危害，烟碱降解到何种程度是重要问题。申请者筛选到一株可降解烟碱的嗜烟碱节杆菌Z3。在此基础上，通过生物合成方法获得烟碱降解手性中间体6-羟基-L-烟碱，阐明该中间体相对于烟碱的吸食安全性和生理功能。通过PCR扩增获得6-羟基-L-烟碱氧化酶编码基因6hlno，构建原核表达载体pET-30a(+)-6hlno，转入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中并得到表达，通过IPTG终浓度和诱导时间优化得到最佳IPTG终浓度为0.25mmol/L，诱导5h，6-HLNO蛋白的表达量占总菌体蛋白的39.57%，并以包涵体形式存在；以烟碱为底物，采用分析型HPLC监测节杆菌Z3发酵反应，目标产物6-羟基-L-烟碱最佳积累时间为24小时；以乙酸乙酯：甲醇：氨水体积比（6:1:0.01）的混合溶剂为洗脱剂，采用柱层析法对目标产物分离纯化经分离纯化，产物纯度为99.00%。利用旋光仪，UV，IR，1HNMR，13CNMR及MS对其结构进行表征证实了烟碱代谢中间产物6-羟基-L-烟碱。并阐述了节杆菌Z3利用尼古丁合成6-羟基-L-烟碱的代谢机理；烟碱与6-羟基-L-烟碱在300℃，600℃，900℃条件下，几乎均不发生裂解反应，可能由于沸点低的原因，这两种物质在模拟卷烟抽吸过程中，主流烟气6-羟基-L-烟碱均以游离态的形式直接进入“口腔”内，侧流烟气6-羟基-L-烟碱以游离态的形式挥发进入空气中。通过内标法测得6-羟基-L-烟碱卷烟烟气转移率为51.02%。6-羟基-L-烟碱在卷烟主流烟气中具有较高的转移率，表明6-羟基-L-烟碱的稳定性较好，有助于游离态的6-羟基-L-烟碱转移到主流烟气中，可能对抽吸的生理强度具有一定的支持作用；测试的烟碱纯品小鼠灌胃急性致死剂量为2~2.5 mg，烟碱降解产物6-羟基烟碱按烟碱同样剂量给小鼠灌胃后，均表现正常，未见急性毒性反应和急性死亡。通过烟碱和6-羟基烟碱的急性毒性试验、慢性毒性试验的对比均表明：低剂量的烟碱对小鼠的器官不会造成危害，长期摄入高剂量的烟碱会造成小鼠体内器官的病变； 6-羟基烟碱相比于烟碱基本上不具有毒性。感官评价结果表明6-羟基-L-烟碱作为烟