集聚蛋白agrin在A型肉毒毒素诱导新生神经肌肉接头形成中的作用机制研究

Botulinum toxin type-A (BTX-A) has been widely used in the treatment of dystonia, however, it’s the effective duration time is limited. The formation of new neuromuscular junction (NMJ) has been confirmed as the main cause of reducing curative effect of BTX-A. However, the molecular mechanism of new NMJ formation remains unclear. Neurotrophic factor, agrin, has been proved to exert pivotal roles in inducing late stage of synaptic differentiation and stabilization. Our previous studies have found that the expression of agrin showed a very close correlation with the change of muscle strength after injecting BTX-A in rat gastrocnemius muscle, and that miR-144 could regulate the expression of agrin has been found in our subsequent research. The previous results highly prompt agrin may regulate the formation of new NMJ induced by BTX-A, which may be regulated by miR-144. The project, on the basis of previous studies, intends to verify whether agrin regulates the formation of new NMJ, in which whether miR-144 regulates the expression of agrin. Our project, focusing on agrin and miRNA, will lay the foundation for revealing the molecular mechanism of new NMJ formation induced by BTX-A, and provide new insights into exploring approach to prolong the effective duration time of BTX-A.

BTX-A诱导的新生神经肌肉接头发生已被证实是其治疗局限性肌张力障碍等疗效衰退的主要原因，但目前新生神经肌肉接头形成的机制不明。集聚蛋白agrin对发育晚期神经肌肉接头的成熟及稳定均具有重要作用，我们前期研究发现BTX-A注射大鼠腓肠肌后肌力恢复过程中agrin的表达变化与肌力变化的关系密切，进一步研究发现miR-144可以靶向调控agrin的表达，这高度提示agrin参与BTX-A诱导的新生神经肌肉接头形成，并且该过程受到miR-144的表观调控。本项目拟在前期研究基础上，将分别从体内和体外两方面验证agrin参与调节BTX-A诱导新生神经肌肉接头形成，同时验证miR-144在agrin调节神经肌肉接头分化中的表观调控作用。本研究将从集聚蛋白agrin及调控其表达的miRNA这个视点为揭示BTX-A诱导新生神经肌肉接头形成的分子机制奠定基础，为探讨延长BTX-A作用时效提供新的思路。

研究背景 肉毒毒素（Botulinum neurotoxin, BoNT）目前已被广泛用于医疗美容以及神经系统疾病的治疗，如痉挛性斜颈、卒中后肢体痉挛、面肌痉挛及雷诺综合征等。然而，BoNT单次注射后疗效持续时间有限。既往研究已证实BoNT作用衰退与注射部分代偿性神经芽生有关。因此，抑制BoNT作用后的神经芽生是延长其作用时间的重要途径，也是当前肉毒毒素临床应用方向研究的热点。然而，目前有关BoNT作用后诱导神经芽生的分子机制不明，因此，缺乏抑制神经芽生的有效干预靶点。研究内容 本研究我们首先检测了A型肉毒毒素（BoNT/A）注射后神经源性调节因子集聚蛋白agrin水平及大鼠腓肠肌乙酰胆碱受体（AChRs）数量的变化，分析了agrin对BoNT/A注射后诱导神经芽生的作用。然后，探讨了agrin作为延长BoNT/A疗效干预靶点的可能性。最后，从上游神经源性信号通路和下游肌源性信号通路两方面初步探讨了agrin影响BoNT/A疗效的分子机制。研究结果 我们实验结果显示在BoNT/A注射大鼠腓肠肌后短期内抑制了腓肠肌神经肌肉接头突触前膜释放agrin，导致突触后膜AChRs的稳定受到影响，数量减少，而后续agrin表达升高，调节神经芽生形成；利用抗agrin抗体暂时性阻断agrin的功能可以抑制BoNT/A诱导的神经芽生，继而延缓大鼠腓肠肌肌力的恢复，延长BoNT/A作用时长。此外，进一步研究表明agrin通过调节下游肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）的表达来影响BoNT/A诱导的神经芽生，进而影响BoNT/A的作用时长，并且我们还发现agrin的表达受上游miR-144的调控。研究意义 通过本研究，我们首次发现了BoNT/A亦通过抑制突触前膜agrin的释放影响AChRs的稳定，参与抑制肌肉收缩，进一步丰富了BoNT/A的作用原理；后续我们证实了agrin参与调节BoNT/A诱导的神经芽生，并发现了调控神经芽生的miR-144-agrin-MuSK信号通路，丰富了神经芽生的分子调控网络。本研究为延长BoNT/A作用时间提供了新的潜在的干预靶点。