纯钛表面自由能的调控引导Fn功能构象激活Rho家族GTPases激酶通路促进成骨细胞粘附的机制研究

Our previous studies showed that the surface of pure titanium with high surface free energy and hydrophilic has better performance on osteoblast adhesion, proliferation, differentiation and mineralization, but its internal mechanism is not yet clear. The first step of osseointegration is the recognition and adhesion of osteoblasts to the material. The study of the adhesion behavior of osteoblasts has become an important part of the understanding of the surfaces with difference free energy. As an important adhesion protein in extracellular matrix, fibronectin mediates the adhesion and identification of osteoblast to material surface. In this process, the change of adsorption capacity, functional conformation, RGD binding domain exposed or not, and the subsequent Rho GTPases family kinase pathway activation and expression, has become one of the most important aspects of the osteoblast functions. Therefore, this topic will analyze the different surface free energy of pure titanium surface influence on fibroection protein adsorption quantity, at the same time further analysis its close and loose type conformation with the features of RGD domain, and the activation and expression of Rho family GTPases kinase pathway to discuss the change of osteoblast adhesion behavior. Finally, the inner mechanism of different surface free energy of pure titanium surface affect the behavior of osteoblast adhesion is discussed in this paper.

前期研究结果显示高表面自由能且亲水的纯钛表面在成骨细胞的粘附、增殖、分化和矿化上都具有更佳的表现，但其促进成骨的内在机制目前尚未明确。骨结合形成的第一步是成骨细胞对材料的识别和粘附，研究成骨细胞粘附行为的发生成为了探讨不同表面自由能表面成骨活性差别的重要内容。其中，纤维连接蛋白作为细胞外基质的重要粘附蛋白，其介导着成骨细胞对材料表面的识别和粘附。在这个过程中，纤维连接蛋白的吸附量、构象变化包括RGD功能结合域的暴露与否，以及后续Rho家族GTPases激酶通路的激活与表达成为了成骨细胞功能实现的重要一环。因此，本课题将分析不同表面自由能纯钛表面对纤维连接蛋白吸附量的影响，同时对其紧密型和疏松型构象所展露的RGD功能结合域进一步分析，并以Rho家族GTPases激酶通路的激活与表达来讨论成骨细胞粘附行为变化的内在机理，最终完成不同表面自由能纯钛表面影响成骨细胞粘附行为的机制探讨。

种植体表面理化特性的优化可以促进其骨结合效能。其中，种植体表面的元素、电荷、形貌特征、表面自由能(SFE)等的改性是目前关注的重点方面。该项目的主要研究内容是探讨SFE对纤维连接蛋白(FN)的吸附和构象的影响，以及其对后续成骨细胞生物学行为的影响。实验设计采用纯钛酸蚀表面，分为两个组别，其中高表面自由能组（H-SFE)钛片用30w紫外光照射，低表面自由能组(L-SFE)钛片则不做处理。利用扫描电子显微镜、光学表面轮廓仪、x射线光电子能谱和接触角测量仪对钛片的表面特性进行研究。利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法研究了不同表面吸附的FN的构象差异。将MG-63细胞培养在有FN预处理的钛片上，观察其体外生物学活性。实验结果表明，与L-SFE组相比，H-SFE组吸附了更多的FN，在二级构象上含有更多的β-turn结构，而β-turn结构与细胞的黏附相关。MG-63细胞在FN预处理的H-SFE钛片上具有较好的生物学活性，包括粘附、增殖、碱性磷酸酶活性和矿化等。H-SFE组上细胞在3，6，24h的时间点上，细胞的黏附数量、增值速率、分化和矿化都比L-SFE组的细胞更优。整合素β1、整合素α5、FAK、Src、RhoA等基因与细胞局灶性黏附相关，Rac-1与细胞迁徙相关。MG-63细胞在FN预处理的H-SFE上培养3h后，发现整合素β1、整合素α5，FAK、Src、RhoA以及Rac-1的mRNA水平高于L-SFE组。整合素β1、整合素α5，Rac-1显著升高，说明此时H-SFE组的细胞除了发生黏附之外，可能已经出现了细胞迁徙的活动。以上这些结果表明，与L-SFE相比，H-SFE组较高的SFE能促进FN的吸附并获得更多的β-turn结构，从而进一步增强MG-63细胞的成骨活性。