热诱导家蝇幼虫cDNA文库中抗菌功能基因的筛选、克隆及表达模式研究

先天性免疫系统是多细胞生物抵抗各种微生物入侵的第一道防线，目前在无脊椎动物昆虫体内已发现了多个免疫活性物编码基因，但仍还存在大量的未知免疫相关基因，编码不同的抗菌物参与昆虫的免疫防御。家蝇由于生活环境特殊，形成了极强的先天免疫保护体系。课题组前期对蝇幼虫体内的免疫活性物质进行了分离纯化，测定了部分活性肽氨基酸序列，并成功构建了热诱导家蝇幼虫的cDNA质粒文库。在此基础上，我们拟采用菌落活性染色法，从cDNA文库中筛选与抗菌功能相关的基因，采用EST测序技术和RACE技术获得2~3个功能基因的全长cDNA，基因克隆和表达；同时，采用实时荧光定量PCR技术，分析筛选到的2~3个功能基因在家蝇的不同时期、不同组织部位及经不同的病原微生物应激下的表达调控规律，从分子水平揭示这些基因在家蝇免疫防御体系中的作用，为进一步研究家蝇免疫的机制奠定基础。

先天性免疫系统是多细胞生物抵抗各种微生物入侵的第一道防线，目前在无脊椎动物昆虫体内已发现了多个免疫活性物编码基因，但仍还存在大量的未知免疫相关基因，编码不同的抗菌物参与昆虫的免疫防御。家蝇由于生活环境特殊，形成了极强的先天免疫保护体系。课题组成功构建了热诱导家蝇幼虫的cDNA质粒文库。在此基础上，我们采用菌落活性染色法结合细菌诱导后家蝇转录组数据库的结果，从家蝇体内筛选到了几个与抗菌功能相关的基因：家蝇14-3-3（MD14-3-3）基因、家蝇几丁质酶基因(MDC)、家蝇热休克蛋白基因（MD-CCT）、MSP基因。我们对这些基因及其编码的蛋白序列进行了生物信息学分析；构建原核重组质粒，IPTG诱导表达获得重组蛋白；使用纯化得到的各重组蛋白作为抗原免疫家兔，获得多克隆抗体血清，采用Western-blot方法对重组蛋白进行鉴定；体外检测了重组MD14-3-3蛋白、重组MSP蛋白的抗菌活性；同时，采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术，分析这些基因在家蝇的不同发育时期、不同组织部位及经不同的病原微生物（革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌）诱导后的表达谱变化。结果显示，经PCR扩增后，我们得到了上述基因的目的条带，成功构建了pET-28a重组质粒，转化到原核表达载体中，得到了重组融合蛋白；获得了重组MD14-3-3及MSP的多克隆抗体血清，Western-blot验证成功；体外抗菌活性结果显示，MD14-3-3对大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用，而MSP则对白色链珠菌显示了强的抗真菌活性；上述各基因在家蝇发育的各个时期几乎都有表达，在3龄幼虫内表达量均较高，而MD-CCT则在卵期表达较高；MDC在唾液腺高表达、MD14-3-3在气管高表达、MSP在马氏管高表达；经不同微生物诱导后，各基因均出现了不同程度的表达上调，提示这些基因在家蝇的免疫防御体系中，均起到了积极的防御作用。尤其是MSP基因，该基因BLAST后与其他基因同源性较低，但显示了较强的抗真菌作用，而且该基因在家蝇经真菌诱导后转录组测序高特异表达，与本研究抗菌活性结果相符，推测其是家蝇体内一新抗真菌肽。本研究筛选到了家蝇体内与抗菌功能相关的4个基因，并从分子水平和蛋白水平验证了这些基因的抗菌功能，研究结果进一步丰富了家蝇免疫防御体系，为进一步探讨家蝇免疫机制奠定一定基础。