真菌病毒UvNV-1的程序性+1核糖体移码信号元件的结构和功能研究

Programmed ribosomal frameshifting（PRF）is used by many virus to regulate the production of structural and enzymatic proteins. Altering the frameshifting efficiencies disrupts the virus life cycle and eliminates or reduces virus production. Ribosomal frameshifting therefore provides a unique target on which antiviral agents can function.Based on our previous studies, Ustilaginoidea virens nonsegmented virus 1(UvNV-1) was found to be expressed via a programmed +1 ribisomal frameshift within the sequence CCC-UUU-CGA. Related sites are identified.in other virus genes that have previously been proposed to be expressed via +1 frameshifting. As these viruses infect insects (chronic bee paralysis virus), plants (fijiviruses and amalgamaviruses) and vertebrates (influenza A virus), such motifs may for a new class of +1 frameshift-inducing sequences that are active in diverse virus.Here, we applied mass spectrometry, genetic mutation analysis and other methods,to analyze element of frameshifting and the frameshifting efficiency; to investigate the function of frameshift site(CCC-UUU-CGA) and.“stem-loop”structure. Moreover, this study was to investigate the antiviral activity by altering the frameshifting efficiency of PAP , spermidine and two peptidyl-transferase inhibitors against UvNV-1. Collectively,results of this study tell us the function of frameshift site (CCC-UUU-CGA) and“stem-loop” structure and to evaluated whether programmed +1 ribosomal frameshifting of UvNV-1 as a target for antiviral agents , have laid a solid foundation for the related programmed +1 ribosomal frameshifting of virus as a target for antiviral agents.

程序性核糖体移码(PRF)是一种蛋白质翻译调节机制，参与调节病毒复制酶和结构蛋白的产生。研究发现，病毒的PRF效率改变，会引起病毒数量的变化，其作为抗病毒药物靶标研发已展示良好的前景。基于申请人发表在《Virology》上以及近期的研究工作得知，真菌病毒UvNV-1复制酶的翻译过程涉及程序性+1核糖体移码(+1PRF)，但其作用机制尚不清楚。本项目拟采用遗传突变分析等方法，分析UvNV-1的+1PRF信号元件（移码序列和“茎环”结构）的结构以及它们在+1PRF中的作用。另一方面，分析美洲商陆抗病毒蛋白、亚精胺和肽酰转移酶抑制剂能否通过影响UvNV-1的+1PRF效率而改变UvNV-1的复制能力。本项目的研究不仅有助于阐明真菌病毒UvNV-1的+1PRF信号元件结构和作用机制，初步评估UvNV-1的+1PRF作为抗病毒药物靶标的潜力，而且能为其他病毒中的+1PRF相关机制的研究提供重要依据。

随着流感病毒A中+1核糖体移码的发现，（NNN_UUU_CGN; N=A,U,G,C）序列被鉴定为+1核糖体移码的可能性位点，而且存在于不同寄主生物体的病毒中，包括真菌病毒UvNV-1, 揭示NNN_UUU_CGN是一类广泛被使用的+1核糖体移码位点。本项目在哺乳动物细胞的双荧光素酶检测系统中,对NNN_UUU_CGN中的A位点的16种突变体和E位点的64种突变体进行了移码效率评估，从而推测移码A位点和E位点的作用。实验结果表明，1）UvNV-1的+1移码效率约为1%；2）16种A位点突变体中，CGN的+1移码效率比其余突变体移码效率高；3）64种E位点突变体的移码效率没有体现较明显的规律性。基于物种密码子偏好性不同，我们计划在哺乳动物细胞和真菌细胞的双荧光素酶检测系统对真菌病毒的+1移码效率进行比较研究。因此，我们进行了真菌细胞中的双荧光素酶检测系统的构建和分离鉴定更多的存在（NNN_UUU_CGN）类型+1核糖体移码现象的真菌病毒进行核糖体移码效率的检测。结果未能成功构建真菌细胞中使用的双荧光素酶检测系统，但分离到2种存在（NNN_UUU_CGN）类型+1核糖体移码现象的真菌病毒EgZV1和EgZV2，它们同样在A位点突变体为CGN时移码效率高于其余突变体。因此，我们推测真菌病毒UvNV-1的+1核糖体移码是由于A位点CGN的稀有性被缓慢解码，从而使A位点空置时间延长，P位点tRNA向+1方向移动导致+1核糖体移码现象的产生。然而，这种类型的+1核糖体移码广泛的存在于各种昆虫病毒、植物病毒和真菌病毒中，在所有物种中CGN是不是都是稀有密码子有待进一步的探究。本项目的完成为存在（NNN_UUU_CGN）类型+1核糖体移码的植物病毒、昆虫病毒的相关研究提供了一定的理论基础和借鉴。