PRRSV程序性-1核糖体移码信号的结构和功能的研究

PRRSV复制酶翻译过程涉及程序性-1核糖体移码，但PRRSV程序性-1核糖体移码信号的结构和作用机制尚不清楚。为研究PRRSV程序性-1核糖体移码信号的结构和移码机制以及移码在病毒生命周期中的作用。本研究拟采用遗传突变分析、核酸酶作图和反向遗传操作等分子生物学方法，分析PRRSV程序性-1核糖体移码信号的结构和移码效率；解析该移码信号中的两个顺式作用元件（滑动序列和刺激元件）在移码事件中所起的作用；在以上研究的基础上，结合本研究室已建立的PRRSV反向遗传操作系统平台，研究程序性-1核糖体移码信号对病毒复制酶翻译过程的调控作用。研究结果将解析PRRSV-1核糖体移码信号的结构和作用机制及该类顺式作用元件在病毒复制过程中的作用，为发现潜在的抗病毒靶标奠定理论基础。

通过软件Mfold预测，获得的PRRSV-1PRF信号由滑动序列UUUAAAC和其下游的假结结构组成。为分析-1PRF信号的移码效率，我们构建了双荧光素酶报告载体pBL-A。并将预测的信号位点克隆到双荧光素酶报告载体中，构建克隆pBL-SK，分析PRRSV-1PRF信号介导的移码效率大约为8%。.为分析滑动序列对核糖体移码效率的影响，在pBL-SK的基础上，构建了滑动序列突变克隆，分析这些突变对移码效率的影响发现，将滑动序列突变成其他病毒的滑动序列，发现这些位点的突变对核糖体移码信号的移码效率影响不大，突变克隆有着与野生型克隆pBL-SK相似的移码效率。对滑动序列中的C进行突变成A,T或者G，发现C突变成A后者T，并不影响核糖体移码信号的移码效率，但是突变G后，移码效率大大的降低。将滑动序列中的任何一个核苷酸突变成G，从而破坏了滑动序列的三联码结构，除了突变成GUUAAAC，并不影响核糖体移码信号的移码效率外，而其他克隆的移码效率大大的降低。.为进一步证明假节结构在介导移码过程中的作用，在质粒pBL-SK的基础上，将茎I结构的左下半部分进行了突变成其互补的核苷酸序列，构建了质粒pBST1DL。同样地，将茎结构的右下半部分序列突变成其互补的核苷酸序列，构建了质粒pBST1DR，通过茎左下半部分左右核苷酸进行互换，保持茎的结构不变，构建质粒pBST1DC。同样的方法对茎的上半部分进行了突变，构建了质粒pBST1UL，pBST1UR和以及左右互补的克隆pBST1UC。接着，对茎II结构进行了突变，构建了左部分和右部分的核苷酸突变的突变克隆pBSLL和pBSLR以及左右互补的克隆pBSLC。结果表明，破坏了茎的结构，影响了核糖体信号的移码效率。恢复突变了茎I和茎II的结构，移码效率恢复至70%以上。这些结果表明了假节结构对移码效率起到非常重要的调节作用。.为研究核糖体信号对病毒感染性的影响，将双荧光素酶载体中核糖体信号的突变位点同样的导入PRRSV全长感染性克隆中，构建了一系列的核糖体信号突变克隆。结果发现，异源性的滑动序列能够替代PRRSV滑动序列功能，这些能够产生感染性病毒粒子。其他克隆均未能产生感染性的病毒粒子。说明了对核糖体移码效率的降低，影响了病毒复制转录过程，未能拯救出病毒。