泛素连接酶UBR5介导的FANCD2蛋白降解在范可尼贫血通路中的作用及机制

Fanconi anemia pathway repairs DNA interstrand crosslinks (ICLs) in the genome and relates to tumorigenesis and chemotherapy resistance. The mechanism underlying the FA pathway key factor FANCD2 remains unknown. Through a proteomic mass spectrometry screen approach using newly developed 3XFLAGHA tagged Fancd2 knock-in mouse strains, we identified UBR5 as novel Fancd2 interactor. Furthermore, UBR5 selectively bind and mediate Fancd2 proteolysis in the absence of Fanca. Therefore, we hypothesis that UBR5 play a role in FA pathway by regulating FANCD2 stability. In this project, we set to further analyze the function domain of UBR5 and FANCD2 modification site. Subsequently, we set to understand the role of UBR5 in FANCD2 stability and FA pathway DNA repair function. Finally, we will determine whether UBR5 inhibition and FANCD2 stabilization can alleviate the FA related phenotype in FA-/- cell lines and more importantly in the FANCA-/- mice. The results of this project will reveal the molecular mechanism of UBR5 in FA pathway and benefit the future development of FA therapy.

范可尼贫血信号通路 (Fanconi Anemia, FA)是研究DNA损伤修复和肿瘤发生机制以及肿瘤治疗药物敏感性的重要模型。FA信号通路核心蛋白FANCD2调控的分子机制还不明确。我们通过构建FANCD2-3FLAGHA定点敲入转基因小鼠，分离纯化FANCD2蛋白复合物，发现并验证E3泛素连接酶UBR5选择性的与非单泛素化FANCD2蛋白结合、介导FANCD2蛋白降解。据此推测UBR5通过调控FANCD2蛋白稳定性，影响FA通路功能。本项目中我们将进一步明确UBR5与FANCD2蛋白结合的功能区域以及FANCD2修饰的氨基酸位点；阐明UBR5对FANCD2蛋白稳定性及其在DNA损伤修复联级反应中功能的调控作用；最后分析抑制UBR5对FA-/-细胞与FANCA-/-小鼠造血干细胞中DNA损伤修复缺陷表型的缓解作用，为UBR5成为FA治疗新靶点提供理论基础。

范可尼贫血通路主要参与细胞DNA交联损伤修复，维护基因组稳定性与完整性。目前已知22个范可尼贫血通路基因，其中的任何一个发生突变，都会影响机体生长发育、损伤干细胞功能、诱导肿瘤发生，临床上造成遗传性范可尼贫血综合症。系统探究范可尼贫血通路蛋白功能有重要的生物学意义。本研究使用基因修饰小鼠模型、实验血液学方法、蛋白功能分析等手段剖析范可尼贫血通路的核心蛋白 FANCD2的生理功能与分子调控机制。本课题（1）首先通过构建与分析FANCD2基因敲除小鼠模型，分析 FANCD2蛋白在机体发育、干细胞分化、细胞周期中的功能，揭示FANCD2参与非范可尼贫血通路的DNA损伤修复功能。（2）分析FANCA基因敲除情况下，泛素化连接酶UBR5对非泛素化修饰的FANCD2蛋白稳定性的调控作用。（3）分析FANCD2下游功能蛋白FANCM缺失小鼠，揭示FANCM蛋白在机体生殖器官发育中功能，分析FANCM参与减数分裂过程DNA损伤修复的机制。以上结果为进一步了解范可尼贫血通路蛋白参与DNA损伤修复的分子机制提供重要依据，项目过程中建立的FA亚型小鼠模型库与表型分析数据库，为后续FA的临床诊断与治疗提供重要的前期理论与实验基础。