哺乳动物基因组DNA中甲基胞嘧啶氧化修饰调控机理的研究

DNA methylation regulates gene expression in multiple biological processes. Formation of genomic methylation patterns is determined by two opposing events, de novo methylation and demethylation. It is well known that genome-wide demethylation occurs in the early embryo and primordial germ cells. But important questions about demethylation mechanism remain unanswered, partly due to the fact that the developmental stages of DNA demethylation is not easily accessible for conventional molecular biology approaches. In the past years, several labs including ours revealed that DNA demethylation may take place through Tet dioxygenase-mediated oxidation of 5-methylcytosine. The crucial proof of this proposed pathway has to be provided by identifying factors that can actively remove the oxidation product - 5-carboxylcytosine from DNA. In our preliminary work, we have found a few candidate proteins which can reduce 5caC when expressed in transfected cells. The proposed study will focus on biochemical characterization and functional confirmation of these factors during early embryo development and germ cell formation in mice. Identification of factors that regulate or remove the 5mC oxidation derivation will contribute to understanding of the mechanism of DNA demethylation.

DNA甲基化通过调节基因表达控制诸多生命活动过程。DNA甲基化谱式的建立涉及DNA去甲基化和起始性甲基化。以主动去甲基化为特征的、发生于胚胎发育早期和生殖细胞发生过程中的表观遗传重编程分子机理是一个尚未解决的重大问题。由于此类重编程过程发生于难以用常规分子生物学手段进行研究的特殊发育时期，对于DNA去甲基化机理的探索一直进展不大。然而在过去的两年中，包括申请人实验室在内的几个研究组发现去甲基化有可能通过Tet双加氧酶介导的甲基胞嘧啶（5mC）的氧化来实现。目前验证这一假说的关键是要找到去除5mC氧化产物-羧基胞嘧啶(5caC)的生化途径。我们拟在业已建立的5caC 调节蛋白筛选与鉴定平台的基础上，对候选蛋白进行深入的生化和遗传学分析，在早期胚胎和生殖细胞中检验其生物学意义。具体目标是鉴定参与调节5mC氧化产物的蛋白因子，阐明其在DNA去甲基化过程中的作用，明确DNA去甲基化的分子机制。

DNA甲基化通过调节基因表达控制诸多生物学过程。DNA甲基化谱式的建立涉及DNA起始性甲基化和去甲基化。课题组研究人员前期发现了Tet双加氧酶介导的5mC氧化和TDG糖苷酶介导的碱基切除修复途径构成的DNA主动去甲基化通路。然而，有关调控Tet-TDG介导的去甲基化途径的因子的报道还不是很多，并且该途径可能并不是生物体内唯一的去甲基化途径。为了完善DNA去甲基化的分子机制，本项目中我们利用双荧光素酶报告系统进行了筛选，发现Gadd45a通过刺激TDG酶活介导DNA去甲基化，而UNG2作为除TDG外的另一个糖苷酶可以促进Tet双加氧酶介导的的DNA去甲基化。.此外，本项目中我们利用体细胞重编程模型和小鼠敲除模型对Tet双加氧酶介导的DNA去甲基化的生物学意义进行了分析。结果显示：维他命C是决定TET1生物学功能的关键因素，TET1在Vc存在的情况下通过调控间充质向上皮转化过程（MET）而抑制了重编程，没有Vc的情况下TET1则可以促进重编程，并且这种促进作用与其对MET的调控无关；Tet和TDG介导的DNA去甲基化在体细胞重编程中对MET这一过程是必需的，二者的缺失直接导致重编程的障碍；哺乳动物受精卵雌雄原核中存在Tet双加氧酶介导的DNA主动去甲基化和DNA复制介导的被动去甲基化，并且TDG在雌雄原核的DNA去甲基化过程中并非必需；Tet双加氧酶介导的DNA去甲基化与Dnmt甲基转移酶介导的DNA甲基化共同作用，通过调控Lefty-Nodal信号通路调节小鼠原肠运动。.鉴于TDG在Tet3介导的小鼠受精卵原核DNA去甲基化中并不是必需的，本项目中我们还试图制备Tet3-Flag-HA knockin小鼠模型，期望通过免疫共沉淀结合蛋白质谱技术寻找与Tet3相互作用的因子，以寻找潜在的Tet3的下游因子。