体细胞克隆牛基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶表观遗传修饰差异研究

Epigenetic modifications are of high importance to understand the efficiency of animal somatic cell cloning. We previously found that repressive epigenetic modifications exhibited distinct aberrance on the inactive X chromosome in live clones, whereas gene activating modifications were largely normal. In order to verify and further explore this interesting result, we choose 5mC and 5hmC, two closely associated epigenetic modifications, as subjects of study in this proposal. 5mC is an epigenetic modification associated with gene expression, but the function of 5hmC, which is involved in the process of DNA demethylation, is unknown. The 5hmC is very likely associated with activation of gene expression. We are planning to employ several technologies to examine the 5mC and 5hmC modifications in somatic cloned cattle, and to hunt for the differences at the specific loci. The other epigenetic modifications on these loci will be further examined. We think that this will deepen our knowledge and understanding of 5mC and 5hmC modifications in cloned cattle, and provide important clues to our understanding of the aberrant development of cloned animals and cloning inefficiency.

体细胞克隆机理是表观遗传研究的重要内容，我们研究发现，在存活克隆牛失活X染色体的多种表观遗传修饰中，抑制基因表达的表观修饰均处于异常状态，而促进基因表达的表观修饰则处于正常状态。为进一步验证和补充这一实验结果，本项目选取DNA甲基化和羟甲基化这对紧密相连的表观遗传修饰作为研究对象，探讨这对修饰在体细胞克隆牛基因组中的分布特征及差异。DNA甲基化修饰与基因表达抑制相关，DNA羟甲基化功能虽未知，但它参与DNA去甲基化过程，极可能与促进基因表达相关。本项目利用多种先进技术（HPLC、MSAP、MeDIP-seq等）检测克隆牛基因组中DNA甲基化和羟甲基化修饰，寻找特异的差异修饰位点，并进一步检测差异位点的其他表观修饰。相信，上述研究将大大加深人们对克隆动物DNA甲基化和羟甲基化修饰的认识和了解，并最终为揭示克隆动物分子机理，解决克隆动物发育异常、克隆效率低下等关键问题提供极为重要理论。

体细胞克隆机理是表观遗传学重要的研究内容， DNA羟甲基化（5hmC）作为新的表观遗传修饰，在体细胞克隆动物中还没有进行过任何研究。本项目选取DNA甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）这对紧密相关的表观遗传修饰，研究它们在不同供体核存活和死亡克隆牛、克隆猪基因组DNA中可能存在的异常和差异。本项目研究有以下几个发现：（1）所有样品基因组中5mC（％）与5hmC（‰）含量相差1个数量级，但二者含量成负相关，即基因组中5hmC含量相对较高的组织细胞，其5mC含量相对较低，反之亦然；（2）在体细胞重编程过程中，无论存活还是死亡克隆动物（牛、猪）DNA 5mC和5hmC含量均有异常，主要表现在死亡克隆动物5mC含量最高，存活克隆动物5mC含量次之，自然繁殖动物5mC含量最低；同样，存活克隆动物5hmC含量高于死亡克隆动物，但低于正常繁殖动物；（3）体细胞克隆牛和克隆猪之间相比较发现，体细胞克隆牛之间5mC和5hmC差异更大；（4）基因组DNA 5mC和5hmC 这2种表观修饰相比较，基因组DNA 5hmC含量在存活和死亡克隆牛中差异程度更大，在所检测的组织中存活克隆牛5hmC含量均高于4‰，而死亡克隆牛组织5hmC均低于2‰；（5）对比单个基因检测位点，存活和死亡克隆牛之间H19基因 DNA 5mC比Xist基因差异要大，存活克隆牛H19 5mC含量一般均低于50% ，而死亡克隆牛5mC含量一般在70%附近。Xist基因DNA 5mC差别不大。此项研究将为解决克隆动物发育异常、克隆效率低下等瓶颈问题提供科学理论依据，从而推动体细胞核移植在动物遗传育种领域的进步与发展。