从TM4细胞自噬角度探讨近江牡蛎多糖对生殖氧化应激损伤的干预机制

Reproductive oxidative stress damage has been identified as a major internal cause of male infertility. In previous experiments, Ostrea rivularis polysaccharide (ORP) could reduce reproductive oxidative stress damage. But its mechanism is still unclear. As reported, autophagy in Sertoli TM4 cells (TM4) could antagonize oxidative stress apoptosis to increase the survival rate of TM4. Previous studies showed that ORP could regulate the expression of p62, which is a key protein of TM4 in autophagy. Therefore, it is speculated that ORP may intervene in reproductive oxidative stress through regulating autophagy of TM4 cell. In order to verify the hypothesis, transmission electron microscope is used to observe the effect of ORP on the technical level of autophagosomes in TM4 in vivo and in vitro. The DCFH-DA fluorescence probe and ELISA kit are applied to analyze influence of ORP on the level of ROS in cells and antioxidant enzyme. Finally, qRT-PCR, Western blot and immunofluorescence are used to detect the effect of ORP on autophagy key proteins (LC3-II, beclin1, p62) and downstream antioxidant pathways. The mechanism of autophagy in reducing reproductive oxidative stress injury of ORP will be discussed in the whole, cell and molecular level, which will provide new ideas for the prevention and treatment of reproductive oxidative stress injury.

生殖氧化应激损伤是导致男性不育的主要内因之一。课题组前期发现近江牡蛎多糖（ORP）能够缓解小鼠生殖氧化应激损伤，但其机制仍不明确。据报道，小鼠睾丸支持细胞（TM4）的自噬作用可拮抗氧化应激导致的凋亡，提高其存活率。课题组前期研究表明ORP能够调控TM4细胞中自噬关键蛋白p62的表达，因此推测“ORP可能通过调节TM4细胞自噬干预小鼠生殖氧化应激损伤”。为验证该假说，通过体内及体外模型，采用透射电子显微镜观察ORP对TM4细胞中自噬体水平的影响；采用DCFH-DA荧光探针、ELISA试剂盒分析ORP对细胞内ROS水平及抗氧化酶的影响；并利用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等手段检测ORP对自噬关键蛋白（LC3-Ⅱ、beclin1、p62）及下游抗氧化通路的影响。从整体、细胞及分子水平探讨自噬在ORP改善生殖氧化应激损伤中的作用及干预机制，为生殖氧化应激损伤的防治提供新思路。

生殖氧化应激损伤是男（雄）性不育主要原因之一，缓解生殖氧化应激损伤是其治疗的主要途径。前期研究显示近江牡蛎多糖（ORP）有抗生殖氧化应激损伤的作用，可能与激活Keap-Nrf2/ARE信号通路有关，但其作用机制仍不明确。后续通过相关实验结果，推测“ORP可能通过调控TM4细胞自噬干预小鼠生殖氧化应激损伤”。.为验证该假说，本研究首先通过体内实验，证实ORP对环磷酰胺（CTX）造成的小鼠生殖系统氧化应激损伤具有保护作用：经CTX诱导后，模型组小鼠体重减轻，睾丸指数显著降低，睾丸明显病变，精子数量、存活率下降，畸形率显著升高，小鼠血清中抗氧化因子含量显著降低，睾丸细胞内自噬明显增加。且随着造模时间的延长，CTX对小鼠生殖损伤更严重。经ORP干预后，小鼠睾丸指数上升，睾丸组织病变情况得到缓解，精子数量、存活率显著上升，畸形率显著降低，睾酮含量显著升高，血清中SOD、GSH-Px含量明显上升。小鼠睾丸细胞中自噬水平明显降低，但与正常组相比，仍存留一定的自噬，且显著高于正常组。表明ORP能够提高CTX致小鼠生殖氧化应激的抗氧化能力，缓解睾丸细胞过度自噬，对小鼠生殖系统起到保护作用。进而通过细胞实验，发现ORP干预后TM4细胞形态明显改善，细胞损伤得到缓解，细胞内ROS水平显著下降，抗氧化因子表达升高；细胞内凋亡相关蛋白表达下降、抗凋亡蛋白表达上升，提示TM4细胞凋亡情况有所改善。同时，自噬相关蛋白LC3II/I比值和Beclin1表达降低，p62表达升高，说明ORP可以减少细胞过度自噬降低凋亡水平从而拮抗小鼠生殖氧化应激损伤。.ORP能够缓解生殖氧化应激损伤和睾丸支持细胞过度自噬，但细胞内仍保留一定的自噬水平以维持细胞内稳态。ORP防治雄性生殖氧化应激损伤的作用不止于调控细胞自噬，在这之间，可能还受其他因素调控。