表达GM-CSF的基因缺失狂犬病病毒的免疫机制研究

Rabies is an old zoonotic disease caused by rabies virus, and its fatility is near 100%.Previous studies indicated that the main difference between the attenuated strain and wild-type strain of rabies virus is that the attenuated strain can activate the host innate immunity while the wild-type strain can evade the host innate immunity. Furthermore, the recombinant rabies virus expressing innate immunity molecues GM-CSF could recruit and activate more dendritic cells to induce the host innate immunity and also could activate more B cells to produce high level of neutralizing antibodies. Recently, the gene-deleted rabies virus, either with deletion of phosphoprotein gene or matrix protein gene, is becoming a focus in the field of rabies vaccine development because of its high saftey and unaffected immunogenictity. Therefore, the gene-deleted rabies virus was chosen as the object of this study. Recombinant gene-deleted rabies virus expressing GM-CSF will be constructed using reverse-genetic technology, followed by the in vitro characterization of the virus. The immunogenicity and the immunogenic mechanism of the rescued recombinant virus will also be investigated. The present study will be helpful for understanding the role of innate immunity molecues in inducing immune response by rabies virus, and will provide a theoretical foundation for the development of new generation rabies vaccine.

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一种古老的人畜共患传染病，其病死率接近100%。研究表明，狂犬病病毒弱毒株和野毒株主要区别为前者激活宿主的先天性免疫而后者则会逃逸先天性免疫。表达先天性免疫分子GM-CSF的狂犬病病毒在免疫后可通过激活更多的树突状细胞来激活宿主先天性免疫，同时还可以激活更多B细胞来诱导产生高水平的中和抗体。最近研究发现基因缺失狂犬病病毒（P或M基因缺失）不仅提高了免疫的安全性而且其免疫原性也未受影响，成为狂犬病疫苗研究领域的热点。因此，本研究拟以基因缺失狂犬病病毒为研究对象，通过反向遗传操作技术获得表达GM-CSF的基因缺失狂犬病病毒，研究该病毒体外的特性，以及GM-CSF的表达对基因缺失狂犬病病毒免疫原性的影响，并探索其免疫机制，从而进一步理解先天性免疫分子在狂犬病病毒诱导免疫反应中的作用，为新型狂犬病疫苗的研发奠定理论基础。

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一种古老的人畜共患传染病，其病死率接近100%，目前没有有效的治疗措施，疫苗免疫是预防本病的最有效手段。本实验室前期研究表明，表达先天性免疫分子（如GM-CSF）的重组狂犬病病毒在免疫小鼠后可诱导产生高水平的中和抗体。由于基因缺失可以降低或破坏病毒的复制，提高其作为疫苗的安全性，因此，本项目利用反向遗传操作技术成功获得了表达先天性免疫分子GM-CSF的基因缺失狂犬病病毒（P或M基因缺失），但由于P或M基因的缺失在提高安全性的同时导致重组病毒体外扩增滴度较低，不是理想的疫苗株。鉴于流浪犬是我国狂犬病的主要传染源，研究用于犬的口服疫苗更具有现实意义。因此，本项目进一步构建了表达犬GM-CSF的重组狂犬病病毒，拟将其作为犬口服疫苗株并进行其口服免疫机制的研究。在体外研究中我们发现犬GM-CSF的表达对病毒体外复制没有影响，且其在感染的BSR细胞中以剂量依赖形式表达GM-CSF；在体内研究中，成功建立了犬狂犬病感染模型，并在犬模型中对该重组狂犬病病毒的免疫机制进行研究，研究发现该重组病毒在口服免疫后主要在扁桃体中进行复制，为免疫起始部位。进一步研究表明在口服免疫后GM-CSF的表达可以通过激活更多的树突状细胞（DC）和B细胞来提高机体的抗病毒中和抗体（Virus neutralizing antibody, VNA）的产生水平，并在攻毒后可提供100%的免疫保护。此外，在本项目研究结果的基础上，我们还构建了可以激活DC的其他细胞因子（HMGB1、IL-15）及DC结合多肽的重组狂犬病病毒，并阐明了其具体的免疫机制。总之，本项目的研究成果将为新型狂犬病口服疫苗的研发奠定理论基础，为我国狂犬病的防控提供有力的工具。