狂犬病病毒糖蛋白致病与免疫逃避机制研究

Rabies is a lethal zoonosis and presents a public health threat. This application will employ methodologies and technologies in molecular virology, neurobiology, bioinformatics, and neuroimmunology to investigate the mechanisms by which street rabies virus evades the innate and adaptive immunity by inhibiting the expression of the glycoprotein. The reverse genetics platforms will be established for both street and fixed rabies viruses and then recombinant rabies viruses will be constructed by exchanging the glycoprotein or its functional domains between the street and fixed viruses, performing codon-optimization and codon-deoptimization for each of the glycoproteins, as well as mutating the lysine residues or the glycosylation sites on the glycoproteins. Each of these constructs will be used to determine its biological properties in vitro and in vivo such as the growth characteristics, level of the glycoprotein expression, the ability to stimulate the innate and adaptive immunity in mice, or viral virulence in experimental animals. Most importantly, each of the viruses or the glycoproteins will be investigated for its ability to interact with ubiquitin for protein degradation and to interact with TLRs for activation of the innate immunity. Completion of these studies will provide better understanding of how street rabies virus evades host innate and adaptive immune responses. We will also establish the intellectual properties for reverse genetics system for China-specific street rabies virus clones. These clones will be the basis for selecting vaccine candidates with strong immunogenicity, low virulence, and high stability, which will have immense impacts in future rabies prevention and therapy.

狂犬病是一种高度致死的人兽共患传染病。本项目将运用分子病毒学、神经生物学、生物信息学、神经免疫学等方法技术研究狂犬病毒通过抑制糖蛋白表达来逃逸先天性和特异性免疫应答的机制。通过建立狂犬病病毒固定毒及街毒反向遗传操作平台，对糖蛋白进行置换，密码子优化/去优化，功能域置换，赖氨酸突变，糖基化位点突变，拯救可表达不同糖蛋白的重组病毒。通过研究重组病毒刺激机体先天性和特异性免疫应答的能力及信号传导通路，明确糖蛋白本身（序列和结构），还是其表达水平刺激机体先天性和特异性免疫应答；通过研究糖蛋白与泛素的相互作用，阐明街毒糖蛋白降解，因此逃逸先天性及特异性免疫应答的机制。该项目不仅从理论上回答狂犬病病毒糖蛋白刺激机体先天性免疫应答，而街毒通过提前降解糖蛋白逃逸免疫监控的原理；建立具完全自主知识产权的狂犬病毒反向遗传操作系统，为筛选狂犬病疫苗候选株奠定基础，在狂犬病预防以及治疗中具有广阔应用前景。

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus， RABV）感染而引起的一种古老的人兽共患病，至今仍对公共卫生安全造成威胁。由于对RABV的致病机制尚未完全解析，导致狂犬病一旦发病，死亡率接近100%。本研究主要以RABV街毒（强毒）和固定毒（弱毒）为研究对象，以树突状细胞（Dendritic cells，DC）为切入点，研究了RABV强弱毒株在免疫逃逸方面的差异及产生差异的具体机制。首先，我们利用DC体外移植的小鼠模型分析了RABV强弱毒株在DC激活方面的差异，发现RABV弱毒刺激的DC回输小鼠后可以提高攻毒后的免疫保护，而强毒刺激的DC回输小鼠后则不能提供免疫保护。进一步利用反向遗传操作系统，通过置换强弱毒株的结构蛋白发现糖蛋白（G）在强毒逃避DC激活中起到关键作用。通过对病毒本身和在DC吸附、入侵、复制过程的研究，发现强毒主要通过降低G蛋白的表达来减少病毒粒子上G蛋白的嵌合量，进而减少了病毒对DC的吸附和入侵，使复制过程中产生更少的Leader RNA，而Leader RNA是通过IPS-1通路激活DC的关键因子。其次，我们将G蛋白分不同的区域通过反向遗传操作构建强弱毒株G蛋白不同区域置换的重组病毒，发现G蛋白的膜外区（ecto domain）是调控DC激活的关键区域，而胞内区（cytoplasmic domain）是调控G蛋白在感染细胞中表达量的关键区域。进一步研究发现在G蛋白膜外区的204位糖基化位点是DC激活的关键位点，同时也在病毒增殖中起到重要作用。上述结果表明DC激活在RABV感染后产生免疫反应中起到重要作用，因此，我们在G蛋白的信号肽后插入了一种可以特异性结合DC的小肽DCBp来激活DC，构建和拯救重组病毒，发现DCBp的插入可以在体内和体外显著激活DC，进一步增加了辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B）的生产，进而提高了免疫后病毒中和抗体VNA的滴度和攻毒后免疫保护率，为新型狂犬病疫苗的研发奠定了基础。