膀胱肿瘤外泌体抑制人自然杀伤细胞功能的机制研究

Tumor releases various factors into tumor microenvironment via secrete exosome. These tumor related exosomal factors can inhibit immunocyte functions and help tumor escaping normal immune surveillance. Various studies showed that, the tumor related exosome contain cytokines, tumor associated ligands and ncRNA, which can inhibit human NK cells functions. In addition, the number and function of NK cells from bladder cancer patient were suppressed. Our previous study showed that the proportion of NK cells in bladder cancer patient peripheral blood was decreased, culture supernatant of T24 (bladder tumor cell lines) can decrease the viability and cytotoxicity of normal NK cells and a kinds of exosome can be separated from the culture supernatant. Based on the current knowledge, we propose the hypothesis that bladder tumor exosome contain pivotal factors which inhibited NK cell functions. This proposal aims to investigate and compare the activity and functions of NK cells from bladder cancer patients and normal NK cells treated by T24 exosome. Meanwhile, we will analysis the major difference of tumor related factors and ncRNA in the exosome from serum of bladder cancer patients, healthy volunteers and T24 cell culture supernatant, hope to reveal the molecular mechanism of bladder tumor exosome inhibit NK cells function in molecular-cell-entirety level and lock the key target factor plaies these role. This project will help to elucidate the way that bladder tumor escape immune surveillance and provide theoretical basis and experimental evidence to develop new ideas and drug target for bladder tumor therapy.

肿瘤可以外泌体为载体释放肿瘤相关因子进入肿瘤微环境，抑制免疫细胞的功能。国内外研究表明膀胱肿瘤患者NK细胞数目和功能下降，且肿瘤外泌体中的细胞因子、肿瘤相关配体和ncRNA等可抑制人NK细胞的功能。申请者前期研究发现膀胱肿瘤患者外周血中NK细胞比例减少；膀胱肿瘤细胞系T24培养上清可降低正常NK细胞存活率，抑制NK细胞毒活性；该上清中存在一种外泌体。据此，我们提出了“膀胱肿瘤外泌体中可能存在抑制NK细胞功能的因子”这一科学假设。本项目拟交叉对比膀胱肿瘤患者NK细胞与经T24外泌体处理的正常NK细胞在活性与功能上的变化及筛选肿瘤患者、健康志愿者血清和T24培养上清外泌体中关键肿瘤相关因子及差异ncRNA，从分子—细胞—整体各层面揭示膀胱肿瘤细胞外泌体抑制NK细胞功能的机制及锁定发挥作用的关键靶标分子。该研究将为阐明膀胱肿瘤逃逸免疫监视的机制提供理论基础和实验依据并为膀胱肿瘤的防治提供新的思路

本项目通过高通量测序分析了膀胱肿瘤细胞及膀胱肿瘤患者尿液外泌体中的差异miRNA表达谱。经过q-PCR验证，筛选出了7条膀胱肿瘤外泌体显著差异表达miRNA，并进一步对这些miRNA的功能进行了分析。功能分析主要朝两个方向进行，即差异miRNA对膀胱肿瘤细胞的自调控作用以及对自然杀伤细胞功能的影响。实验结果发现，膀胱肿瘤细胞外泌体中特异低表达的miR-375对膀胱肿瘤细胞有负调控作用。过表达miR-375后膀胱肿瘤细胞的增殖受到抑制，凋亡增加，细胞迁移能力下降，其与ICAM-1和MMP2这两种迁移相关蛋白的表达下调有关。而过表达miR-100-5p和miR-146a-5p可促进膀胱肿瘤细胞的增殖，同时其对应的抑制物则可抑制膀胱肿瘤的增殖和促进膀胱肿瘤凋亡。通过生物信息学方法预测了miR-100-5p，miR-146a-5p和miR-375的靶基因组。Western blot结果显示，miR-375对膀胱肿瘤细胞的作用和调控与FZD8，c-myc和cyclinD1基因有关，并通过Wnt信号通路发挥作用。通过构建荷瘤裸鼠模型，miR-375对膀胱肿瘤作用的相关动物实验正在进行。初步结果发现瘤内注射miR-375能在一定程度上抑制膀胱肿瘤的生长。在对NK细胞功能的作用方面，由于常规方法对NK细胞转染效率较差，因此尝试了新的转染方式，即将目标miRNA转染至膀胱肿瘤细胞中，培养转染阳性细胞，收集阳性细胞外泌体再去处理NK细胞，能较好的提高NK细胞中目标miRNA的含量。实验结果发现在NK细胞中过表达miR-146a-5p和miR-21-3p后能够抑制NK细胞的功能。其中miR-21-3p能抑制NK细胞激活受体NKG2A，NKG2D和NKP30的表达水平，削弱NK细胞对靶细胞的识别作用。而miR-146a-5p的过表达则可抑制NK细胞对IFN-γ的分泌，削弱NK细胞的细胞毒活性。此部分实验筛选出的miRNA可为未来开发膀胱肿瘤治疗的靶向基因药物和开发针对NK细胞免疫功能增强或抑制的药物而用于肿瘤的免疫治疗或免疫功能干预打下基础。.此外，由临床测序样本筛选出了26条膀胱肿瘤患者尿液外泌体高表达miRNA。此部分结果正由合作单位西安交通大学第一附属医院进行miRNA与临床病程等相关性的分析，用以筛选针对膀胱肿瘤的早期诊断、预后、复发等重要生物标志物。