MLCK调节平滑肌细胞骨架蛋白分子机制的研究

MLCK具有激酶和非激酶活性，在平滑肌收缩中起着重要的作用。我们成功地构建了平滑肌MLCK全长的重组体，能够从整体分子水平上研究MLCK不同功能域的作用。本项目是在上一次基金资助基础上深入研究MLCK非激酶调节平滑肌收缩的分子机制。本研究将利用ATP酶活性测定、体外肌丝滑动实验、肌动蛋白结合实验等手段深入探讨MLCK不同功能域调节平滑肌收缩蛋白（肌动蛋白与肌球蛋白）的相互作用；利用电镜技术研究MLCK不同结构域调节肌球蛋白的构象变化。利用平滑肌细胞（A7r5）研究MLCK对细胞骨架蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白及Vinculin)的动态调节作用和细胞迁移的能力；利用FRET技术研究MLCK调节平滑肌细胞肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互关系，为阐明平滑肌收缩的分子机制提供理论依据。

MLCK具有激酶活性和非激酶活性，在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用。我们成功地构建了平滑肌MLCK全长的重组体(pcDNA3.1-FLAG-MLCK)、PKA结合位点的突变体(pcDNA3.1-FLAG-MLCK-△PKA)、以及CaM结合位点的突变体(pcDNA3.1-FLAG-MLCK-△CaM2)，从而实现了从整体分子水平上研究MLCK不同功能域的作用。本项目是在上一次基金资助的基础上深入研究MLCK非激酶调节平滑肌收缩的分子机制。本研究通过脂质体转染方法将各重组体和突变体转染入血管平滑肌细胞，通过观察细胞增殖和迁移的变化，探寻MLCK调节平滑肌细胞骨架蛋白质分子机制。结果如下：1. MTT和CCK8法检测细胞增殖情况显示，MLCK缺失的Gba-SM4细胞增殖率显著高于野生型Gba-SM4细胞，重组的MLCK和突变的MLCK-△PKA均可以逆转细胞的高增殖，但二者无显著性差异；而突变的MLCK-△CaM2逆转细胞增殖作用不明显。表明在平滑肌细胞增殖方面，CaM 结合域为MLCK非激酶活性所必需的区域。2. BoydenChamber法和划痕法检测细胞迁移情况显示，野生型Gba-SM4细胞迁移效率显著高于MLCK缺失的Gba-SM4细胞，转入重组的MLCK和突变的MLCK-△PKA均可逆转MLCK缺失情况下的低迁移现象，且MLCK-△PKA的逆转作用强于重组全长MLCK。表明在平滑肌细胞迁移过程中，PKA结合域为MLCK非激酶活性所必须的区域。3. 构建了MLCK-△PKA稳定转染细胞系，为日后实验提供了可稳定传代的细胞系，避免瞬时转染效率差异对实验结果的影响。本研究为阐明MLCK的非激酶活性调节平滑肌收缩的分子机制提供了实验依据。