TNF受体1在中性粒细胞内的定位机制及功能研究

目的 中性粒细胞（PMN）凋亡可被TNF-α调节。近年来TNF-α与TNF受体1（TNFR1）在调节PMN凋亡中的作用出现争议，本项目提出如下假设：TNFR1在PMN内的分布影响TNF-α 对PMN的效应，而TNFR1在PMN内的分布又与PMN的功能状态密切相关。为此本项目研究TNFR1在PMN内的定位机制，研究TNFR1在PMN内的定位与TNFR1功能之间的关系。方法 通过诱导人早幼粒细胞系细胞或正常人造血干细胞定向分化获得PMN。用免疫荧光和免疫电镜技术，以不同溶酶体标志蛋白为参照，分析TNFR1定位机制。再用LPS或E. coli刺激PMN，用免疫电镜、免疫荧光、FACS技术检测PMN细胞内和细胞膜上TNFR1分布的变化以及转运蛋白AP3、AP2在其中的作用。用MTT法检测PMN对TNF-α的敏感性。意义 本项目将有助于认识TNFR1胞内定位机制在调节PMN凋亡中的作用。

由于TNFR1是TNFα重要配体之一，因此本项目推测TNFR1的胞内分布变化可能会影响中性粒细胞对TNFα的反应，但由于目前关于TNFR1在中性粒细胞内如何分布还未看见报道，因此本项目首先研究TNFR1在中性粒细胞内的分布。根据研究需要本项目分别用三种方法获得中性粒细胞：一种是用红细胞裂解法结合免疫磁珠法分离纯化外周血中性粒细胞；一种是用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和NB4细胞系细胞分化；一种是用Percoll密度梯度离心法结合免疫磁珠法分离纯化外周血干细胞，然后用GM-CSF和G-CSF诱导粒细胞的产生。用MGG染色法和FACS检测CD11b的方法鉴定中性粒细胞及其纯度，用Western技术检测细胞TNFR1的蛋白水平，用免疫荧光技术和免疫电子显微镜技术研究TNFR1的胞内分布。结果显示，用红细胞裂解法结合免疫磁珠法从外周血分离纯化的中性粒细胞，纯度为90%左右，用于研究新鲜血液样本中的中性粒细胞TNFR1的胞内分布；由于外周血中性粒细胞凋亡较快，所以本项目用诱导造血干细胞定向分化获得的中性粒细胞进行TNFα敏感性试验；用ATRA诱导HL-60和NB4细胞分化的方法获得中性粒细胞，虽然纯度不是很高，但简便、经济，同时也能满足项目的部分要求。Western结果显示，在粒细胞分化过程中TNFR1的表达有高低变化；免疫电子显微镜结果显示TNFR1主要分布在中幼粒细胞、晚幼粒细胞、中性粒细胞的溶酶体样结构中；免疫荧光结果显示，在晚幼粒细胞和中性粒细胞中，TNFR1与CD18有明显共定位，TNFR1与CD63无明显共定位。以上结果提示，TNFR1可能主要分布在中性粒细胞的次级溶酶体。