小胶质细胞介导实验性自身免疫性脑脊髓炎神经损伤及其中药复方作用机制研究

多发性硬化是遗传易患个体与环境因素相互作用而发生的自身免疫性疾病。本研究在提出多发性硬化毒损督脉，戕害脑髓，络损髓伤，败坏形体的病机理论基础上，创立益肾、解毒、通络法。采用易敏感、发病率高、模型稳定的SJL小鼠制作实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）复发－缓解模型，以小胶质细胞活化作为CNS免疫激活和调控的指征，观察小胶质细胞对EAE神经损伤的作用；以ERK1/2信号通路作为神经细胞损伤的信号分子（第一信使），并从急性期与复发期2个时点，分析小胶质细胞的活化与增殖、ERK1/2信号通路各因子在EAE组织损伤之间的关联，揭示EAE的中枢神经系统免疫损伤机制及其中药复方作用环节。从免疫调控和细胞内信号转导两个层面分析中药复方调整免疫紊乱的机制，深入探求中医药治疗多发性硬化的作用机理，为中药治疗多发性硬化提供科学依据。

目的：研究益肾达络饮治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效和机制。方法：（1）用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠，建立急性单相型EAE模型；用PLP139-151免疫SJL小鼠建立复发-缓解型EAE模型。（2）用网络药理学方法筛选益肾达络饮的有效成分，用LPS刺激BV2细胞，并用筛选出的单体进行干预。（3）用HE、luxol fast blue法观察病理学改变；用免疫组化法检测NF-κBp65、IκB-α、iba-1的表达；用Western blot法检测NF-κBp65、IκB-α、IL-2、IL-4、iba-1、Olig1、Olig2、PLP、Ras、p-c-Raf、c-Raf、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2、iNOS、COX、p-p-38、p-38、p-JNK1/2、JNK1/2的表达；用ELISA法检测TNF-α、IL1-β、MCP-1的表达；用RT-PCR法检测CD4、CD8、ZO-1、iNOS、COX、TNF-α、IL1-β、MCP-1 mRNA的表达。结果：（1）中药组CD4、CD8 mRNA的表达降低，ZO-1 mRNA的表达上升，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（2）中药组神经功能评分与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；中药组小鼠的炎性细胞浸润与髓鞘脱失情况较模型组减轻，复发率与模型组比较有明显降低趋势。（3）益肾达络饮可以降低NF-κBp65、IL-2、p-ERK1/2、iba-1的水平，升高IκB-α、IL-4的水平，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（4）双去氧基姜黄素（BDMC）在浓度为0.1至2.5uM时，可以抑制BV-2细胞活化。BDMC可以降低p-ERK1/2、p-JNK1/2的表达，下调LPS刺激下BV2细胞的iNOS、COX-2、MCP-1、IL-1β、TNF-α mRNA的表达，降低COX-2、iNOS、MCP-1、IL-1β、TNF-α的水平，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：（1）益肾达络饮可以抑制免疫细胞和小胶质细胞的活化，减轻炎症反应，保护血脑屏障，促进髓鞘再生，降低EAE小鼠的神经功能评分和复发率。（2）BDMC可以通过抑制BV2细胞ERK1/2、JNK1/2通路的激活，从而减轻BV2细胞介导的炎症反应。