砷对脑TR/CaMK IV通路介导的长时程记忆毒性影响的分子机制研究

It has been strongly concerned that arsenic (As) exposure induces impairment in memory and intelligence of children. However, the toxic mechanism of As is unclear. Our previous studies found that the gene and protein expression levels of Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinase IV (CaMK IV) were down-regulated in the brain of mice exposed to As. The synthetic analysis of protein-protein interaction network model and literatures indicated that CaMK IV is an important protein for modulating long term memory (LTM) in the central nervous system and the thyroid hormone receptor (TR) genes are regulatory factors for expression of the CaMK IV gene. In this study, we propose the hypothesis that “disturbing LTM formation through TR / CaMK IV pathways may be a mechanism of adverse effect of As on learning and memory”. In this study, the expressions of the TRα1, TRβ1 and TRβ2 genes and proteins are detected by quantitative PCR and Western blot. Molecular target regulating transcription of CaMK IV gene is detected by luciferase reporter gene assay. The CREB phosphorylation level in brain is analyzed by fluorescence resonance energy transfer technique. The hippocampal neuron excitatory postsynaptic potentials (EPSP) is also examined using the patch-clamp technique. This study aims at exploring mechanism of molecular regulation and its causation with abnormal neurobehavior so as to provide scientific evidences for clarifying mechanism of As neurotoxicity and prevention from toxicity hazard.

砷暴露儿童伴有智力、记忆力低下，已引起社会高度关注，但砷毒作用机制尚不清楚。我们前期研究发现，染砷小鼠Ca(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV (CaMK IV )基因及蛋白表达水平下调。经蛋白—蛋白互作网络模型和文献分析显示，CaMK IV是调控中枢长时程记忆（LTM）重要蛋白，而甲状腺激素受体（TR）基因是CaMK IV基因表达重要调控因子。本课题提出CaMK IV通路介导的脑LTM形成可能是砷影响学习、记忆功能的毒作用机制假说，用定量PCR和Western blot技术测砷对TRα1, TRβ1 和TRβ2表达影响；用荧光素酶报告基因技术测影响CaMK IV 基因转录的分子靶点；用荧光共振能量转移技术测脑CREB磷酸化水平；用膜片钳技术测海马神经元兴奋性突触后电位（EPSP），探讨砷的毒作用分子调控机制及与神经行为异常之间因果关系，为阐明砷的神经毒作用机制及毒性危害防治提供科学依据。

摘要：目前全球有1亿4千万人口， 我国有1千9百万人口饮用水砷含量超过了世界卫生组织标准: 10μg/L，我国还另有5百万人口遭受燃煤型砷污染。此外，还有砷的职业暴露和白血病患者的医疗暴露。 慢性砷暴露主要表现为肝脏和肾脏损害。 近年发现还有神经系统，尤其是中枢神经的损害，如损害智力及学习能力。以往认为成体大脑神经元不能再生，现认为可以再生。成体神经元再生主要发生在：侧脑室壁的脑室下区和海马齿状回的颗粒细胞亚层。本项目给小鼠饮用4mg/L As2O3水4个月，造成慢性砷暴露模型。利用强迫游泳实验来反映小鼠抑郁情况，用免疫荧光检测大脑神经元再生，同时观察牛磺酸（150mg/kg 体重，每周两次灌胃）的保护作用。结果发现：慢性砷暴露小鼠虽然停止运动的潜伏期没有显著差异，但后四分钟内不运动时间显著延长（162.8±7.7 vs 130.4±11.5, p < 0.05），即慢性砷暴露小鼠存在抑郁情况，这和高砷地区某些人群的调查结果相符合。牛磺酸保护组和砷组比较，可以显著降低后四分钟内不运动时间（124.1±9.0 vs. 162.8±7.7, p < 0.01），并和对照组无显著差异，表现出抗抑郁效果。大脑海马可以调控抑郁状态，砷暴露组海马神经元再生下降，即BrdU+/ NeuN+的百分比较对照组显著降低（64±0.90 vs. 76±1.9%，p <0.05）。牛磺酸保护组的神经元再生百分比为76±1.4%，恢复到了正常水平。该结果提示：砷暴露地区的人口如果定期服用牛磺酸，有可能逆转砷暴露引起的神经元再生抑制及抑郁状况。以往的研究表明，牛磺酸在砷暴露中的保护作用是其抗氧化能力，本项目中大脑海马的蛋白印迹结果显示，牛磺酸可以恢复抗炎因子SOCS3的表达，降低促炎因子IL-1β的表达，提示其抗炎作用也可能是砷暴露中的保护机制。此外，砷暴露小鼠肠道菌群中的砷外排基因ACR3（2）拷贝数显著降低，牛磺酸保护组恢复正常，提示肠道菌群参与砷的代谢。