棉酚抑制头颈部癌细胞生长及对抑癌基因去甲基化作用的研究

DNA启动子甲基化是肿瘤表观遗传学的主要机制之一，被认为是是除基因缺失、基因突变外导致抑癌基因失活的又一主要机制。当抑癌基因发生甲基化后，导致其表达沉默就不能正常转录、翻译合成抑癌蛋白及发挥抑癌作用。我们前期研究结果已初步表明: 棉酚可能通过抑癌基因DNA去甲基化作用途径,激活被抑制的抑癌基因来达到肿瘤细胞的抑制作用。本项目采用头颈恶性肿瘤细胞体外培养及裸鼠种植模型，分别观察分析棉酚对肿瘤细胞生长的影响；通过检测头颈肿瘤细胞在棉酚作用前后相关抑癌基因启动子甲基化变化情况以及相关蛋白的表达情况，研究基因启动子甲基化状态改变与转归；并检测头颈肿瘤细胞去甲基化作用酶在棉酚作用前后的表达情况，探讨棉酚对头颈肿瘤细胞去甲基化作用的可能机制，为临床治疗肿瘤新思路提供理论及实验依据。本项目提出棉酚抑制头颈肿瘤细胞生长可能是通过其逆转甲基化状态作用机制而实现的观点，国内外相关文献中迄今未见报道。

1.研究背景：DNA启动子甲基化是肿瘤表观遗传学的主要机制之一。DNA甲基化是一种基因外修饰，不涉及DNA系列本身的改变，是除基因缺失、基因突变外导致抑癌基因失活的又一重要机制。研究表明，抑癌基因启动子区发生高甲基化导致其表达沉默，就不能正常转录、翻译合成抑癌蛋白及发挥抑癌作用。DNA甲基化是一种可逆过程，可通过去甲基化药物使启动子区发生高甲基化的抑癌基因去甲基化并恢复表达。本课题研究提示，棉酚（Gossypol）可能通过DNA去甲基化作用，激活被抑制的抑癌基因从而抑制肿瘤细胞生长。.2.主要内容：（1）进行头颈肿瘤细胞体外培养，醋酸棉酚（GAA）作用后行MTT检测，分析对细胞生长的影响。进行流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡变化（2）进行甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测细胞相关抑癌基因启动子甲基化变化情况；western-blot实验检测棉酚作用前后细胞相关抑癌基因蛋白的表达情况（3）进行RT-PCR实验，分别检测相关抑癌基因以及去甲基化作用酶（DNTM）mRNA表达情况（4）建立头颈肿瘤裸鼠种植模型，观察棉酚的肿瘤抑制作用及肿瘤组织病理变化。TUNEL技术检测细胞凋亡，免疫组化行CD31检测，统计肿瘤中微血管密度（MVD值）结果。.3.主要结果：（1）棉酚能明显抑制体外培养头颈肿瘤细胞的生长并诱导其细胞凋亡（2）棉酚对相关抑癌基因 (hMLH1,MGMT,E-cadherin,p16）甲基化状态具有逆转作用（3）棉酚能使抑癌基因 (hMLH1,MGMT,E-cadherin,p16）的蛋白表达增高并上调mRNA表达水平（4）棉酚能降低去甲基化作用酶（DNTM）mRNA表达水平。（5）棉酚对人舌鳞癌Cal-27裸鼠移植瘤生长具有抑制作用，并可促进细胞凋亡。其抑制人舌鳞癌Cal-27裸鼠移植瘤生长可能与抑制肿瘤血管生成及降低肿瘤内MVD值有关。.4.科学意义：本研究着重以头颈部恶性肿瘤细胞基因甲基化为特征的表观遗传学标志改变为研究对象和切入点，拟阐明棉酚对头颈肿瘤细胞生长作用的影响以及对头颈肿瘤细胞相关抑癌基因启动子甲基化状态改变与转归情况，并探讨棉酚对头颈肿瘤细胞去甲基化作用机制，为临床治疗相关肿瘤提供一种新的思路和科学理论依据。本研究提出棉酚对头颈肿瘤细胞的抑制作用可能是通过其逆转甲基化状态作用机制而实现的观点，目前在国内外相关文献中尚未见有报道。