抑癌基因启动子异常甲基化及去甲基化干预在胃癌化疗中的作用

申请者在前期研究中发现抑癌基因异常甲基化参与了胃癌的发生发展，同时与胃癌患者预后密切相关，但是抑癌基因甲基化及去甲基化干预在胃癌化疗中的作用尚不明确。本课题拟在前期研究的基础上通过收集200例原发性胃癌每个化疗周期前后的血标本，联合实时荧光定量甲基化特异PCR（RTQ-MSP）法和重亚硫酸盐测序（BSP）法检测抑癌基因Reprimo、CHFR、RUNX3、MGMT、E-cadherin的甲基化水平，探索甲基化指标与胃癌化疗疗效、预后的关系，为胃癌个体化化疗方案的制定提供敏感的分子指标；同时，建立胃癌细胞株和裸鼠胃癌模型，应用去甲基化药物单独或与化疗药物联合应用，检测抑癌基因及核转录因子κB（NF-κB）在干预前后的表达水平，探索去甲基化干预在胃癌治疗中的安全性与有效性，为胃癌临床去甲基化辅助化疗实施提供理论和试验依据。

胃癌发病率与致死率均居所有癌症的前列。目前胃癌的化疗效果欠佳，5年总体生存率不到25%。因此，探讨胃癌发病与耐药机制，用于指导临床个体化治疗，具有重大的临床价值与理论意义。本项目在前期研究证实DNA甲基化与胃癌的发生发展具有密切关系的基础上，为了探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycitydine, 5-aza-dC）与曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）联合化疗药物氟尿嘧啶与紫杉醇抗胃癌的作用及其机制，以三种分化程度不同的胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45和MGC-803为研究对象，首先获得5-Aza-dC及TSA单独或联合作用的剂量与时间反应关系，然后把体外细胞学实验与裸鼠移植瘤模型实验均分为8组，分别为正常对照（PBS缓冲液或生理盐水）、5-Aza-dC、TSA、5-Aza-dC联合TSA、氟尿嘧啶和紫杉醇、5-Aza-dC联合氟尿嘧啶和紫杉醇、TSA联合氟尿嘧啶和紫杉醇，以及5-Aza-dC与TSA联合氟尿嘧啶和紫杉醇处理组，体外实验采用细胞增殖CCK-8检测试剂盒、台盼蓝染色计数法及流式细胞术等方法，比较分析各组药物处理胃癌细胞形态、细胞增殖与凋亡的变化情况；体内实验观察与比较各组肿瘤生长速度，并分析胃癌组织病理染色结果。体内外实验结果均显示5-aza-dC与TSA可以抑制胃癌细胞生长，并能够增强氟尿嘧啶和紫杉醇的抗肿瘤作用。进一步采用甲基化特异PCR、RT-PCR与免疫印迹等方法分析5-aza-dC与TSA的抗瘤作用机制发现，去甲基化药物发挥抗肿瘤作用与其能够降低胃癌抑癌基因RUNX3、Repromin、E-cadherin、CHFR与MGMT的甲基化状态，增强抑癌基因的表达密切相关。同时，通过临床病例研究，发现纳入的183例住院胃癌患者外周血中E-cadherin等抑癌基因异常甲基化发生率接近50%；在接受紫杉醇等化疗药物治疗前后2天内其外周血中抑癌基因异常甲基化率没有明显的变化；随访6个月后，在无进展组患者的外周血中甲基化发生率明显低于进展组患者，提示抑癌基因甲基化检测可作为评估肿瘤预后的一种辅助手段。总之，本研究证实了抑癌基因甲基化在胃癌发生发展中的作用，并发现去甲基化药物具有抑制胃癌生长及增强胃癌化疗效果的作用，为开发胃癌临床治疗药物与预后评估技术等提供了新的思路。