体外多酶级联反应系统的构建及其协同性与稳定性研究

The first-place task of synthetic biotechnology is to construct a library of multi- enzyme components and to assembly them into a cooperative cascade system. Its key scientific issue is the synergy between different enzymes from various sources and the stablity of the cascade multi-enzymatic reaction systems. The proposed project plans first to establish the gene and enzyme libraries of o-chloro-mandelate racemases,(S)-o-chloro-mandelate dehydrogenase,and (R)-o-chloro-phenylglycine dehydrogenase;then to set up a redox-neutral tri-enzymatic tandem deracemization reaction,so as to convert cheap and easily available racemic othero-chloro-mandelate into (R)-o-chloro-phenylglycine,a key intermediate for production of the best-sold drug Clopidogrel (>10 billion US dollars per year), in a green and efficient manner. This project will focus on the construction and characterization of the related enzymes,the cooperativity and stability of the cascade system and technological issues such as optimization, scale-up and kinetic simulation. The results will innovate the reported chemo-enzymatic process and be of significane to develop more eco-friendly and energy-saving processes for manufacturing pharmaceuticals or their intermediates.

合成生物工程学的首要任务是多酶系统的元件建库及其级联组装,其核心科学问题在于不同来源酶分子之间的协同性及体外级联酶反应系统的稳定性。本项目拟通过基因组数据挖掘和分子改造等手段，首先构建邻氯扁桃酸消旋酶、(S)-邻氯扁桃酸脱氢酶和(R)-邻氯苯甘氨酸脱氢酶的基因库和酶库；进而建立一个氧化与还原辅酶类型相同、可以实现内部循环、氧化与还原力之和为零的三酶串联去消旋化反应。目的是从廉价易得的外消旋邻氯扁桃酸出发，绿色、高效地合成全球销售额超过百亿美元的心血管药物氯吡格雷的关键手性中间体- - (R)-邻氯苯甘氨酸。项目将重点研究上述元件酶的筛选与表征、系统的协同性与稳定性等基础科学问题和多酶偶联反应系统的优化、放大和动力学模拟等工程学问题。研究成果对现已报道的化学-酶法偶联工艺将是一个重要的突破和创新，对发展更加绿色环保、节能减排的多酶串联合成药物中间体的先进工艺也具有重要示范作用和推广应用价值。

合成生物工程学的首要任务是多酶系统的元件建库及其级联组装,其核心科学问题在于不同来源酶分子之间的协同性及体外级联酶反应系统的稳定性。本项目首先构建了胺脱氢酶AmDH、醛缩酶LbDERA、羟基类固醇脱氢酶7α-HSDH和7β-HSDH、醇脱氢酶LeADH和ScCR、羰基还原酶库，并对酶库中的关键酶的最适pH、温度、动力学参数等性能进行了表征和评价；其次，利用获得的酶源，构建了醇脱氢酶-胺脱氢酶级联催化外消旋醇合成手性胺、羟基类固醇脱氢酶7α-HSDH和7β-HSDH 四酶两步法催化鹅脱氧胆酸合成熊脱氧胆酸、三酶级联催化外消旋邻氯扁桃酸合成(S)-邻氯苯甘氨酸、醛缩酶-醇脱氢酶级联催化乙醛和氯乙醛合成手性他汀侧链等体外多酶级联反应体系；接下来对醇脱氢酶-胺脱氢酶级联过程中的pH协同性和稳定性进行了优化和考察，确定了最优的反应条件；对羟基类固醇脱氢酶7α-HSDH和7β-HSDH 级联合成熊脱氧胆酸过程中酶活力不匹配的问题，通过分子进化手段进行解决，为熊脱氧胆酸的高效合成构建了协同稳定的催化体系；三酶耦联合成L-苯甘氨酸及其衍生物(S)-邻氯苯甘氨酸体系中的消旋酶活力低而不匹配的问题，我们也通过分子进化的手段进行了克服；最后，对构建的多个体外多酶级联反应体系在0.1-10 L反应器中进行了规模放大规律研究，研究了催化剂的共固定化、反应器类型、操作模式等对放大的影响，为它们的产业化奠定基础。研究成果对多种手性药物合成途径的重要的突破和创新，对发展更加绿色环保、节能减排的多酶串联合成药物中间体的先进工艺也具有重要示范作用和推广应用价值。