工业催化用脱氢酶的稳定化机制和结构改造研究

The needs for application of biocatalysis in green synthesis is rapidly developing. However, the enzyme stability and stress resistance under adverse conditions, such as extreme temperature or pH, strong shear stress, and highly loaded substrate/product/organic cosolvent, are the common and crucial problems that need to be addressed for industrial application. In this proposal, we attempt to resolve and compare the crystal structures of mesophilic and thermophilic alcohol/amine/formate dehydrogenases by X-ray crystallography methods. In addition, the dynamic unfolding process of these activie enzymes as exposed to unfavorable environments will be characterized using spectroscopic methods. These informations could be used to evaluate the structural basis for stabilizing dehydrogenases by monitoring the key intramolecular interactions responsible for resisting their unfolding under industrial conditions and to reveal the mechanism of protein stabilization. The subsequent rational design of hydrogenases for higher stability would greatly improve the industrial application potential of these biocatalysts and also provide strategies for the structure-guided rational design of biocatalyst stability.

生物催化在绿色合成中的应用需求正在迅速增长，然而酶在极端温度/pH、高剪切力、以及高浓度底物/产物/有机助溶剂等工业催化条件下的稳定性(抗逆性)成为其工业应用必须解决的关键共性技术问题。本项目试图采用X-射线晶体学方法对中温及嗜热的醇/胺/甲酸脱氢酶的晶体结构进行解析和比较研究，同时建立逆境条件下观测活性酶分子动态去折叠过程的时变性谱学表征方法；研究揭示蛋白结构中用于抵抗去折叠过程的关键作用及其在不同逆境条件下的稳定化机制，评估脱氢酶稳定性的结构基础。在此基础上，采用分子生物学技术手段有针对性地强化或替换酶的分子内相互作用，发展脱氢酶稳定化改造的理性设计方法，提高酶在生物催化反应过程中的抗逆性能，为完善酶的理性设计与改造方法、创制高效耐用的酶催化剂、推动酶的工业化应用奠定科学基础。

羰基还原酶(或醇/胺脱氢酶)不仅在生物氧化还原代谢中发挥着极其重要的作用，而且在手性醇、手性胺的不对称合成中也具有独特的优势。由于工业上常使用高浓度的底物/产物/有机助溶剂，因此对常规酶的结构稳定性和耐受性构成了极大挑战，成为制约酶工业应用的关键技术瓶颈。本项目采用生物信息学、蛋白质晶体学和分子动力学等方法对不同脱氢酶的序列和结构进行比较分析，同时建立了酶在逆境条件下变性失活过程的实验观测方法；借助结构导向的蛋白质工程和半理性定向进化等手段，研究揭示了酶结构中发挥抵抗去折叠过程的关键残基及其稳定化机制，并自主创制了一批潜在工业用酶。.通过本项目的研究，使得辅酶再生工具―异丙醇脱氢酶的热稳定性提高了433倍，同时辅酶依赖性从NAD(H)转变为NADP(H), 显著拓宽了其应用范围；通过定向进化将葡萄糖脱氢酶对10% 1-苯乙醇的化学耐受性提高9.2倍；基于共进化策略, 将ε-酮酯还原酶的比活力从120 U/mg提升至214 U/mg, 同时其半失活温度提升2.3°C, 使得(R)-硫辛酸酶促合成中的催化剂用量从5 g/L进减少至2 g/L, 显著降低了生产成本，减轻了环境负荷, 有力支撑了合作企业成功上市；类似地，在阿托伐他汀前体的酶法合成过程中，成功将大位阻羰基底物的还原酶效率提高3.2倍，半衰期提高1940倍，底物上载量达到300 g/L, 而酶的用量只有1 g/L, 时空产率达1.05 Kg/L/d，远超美国Codexis公司的专利水平。.在酶法催化鹅去氧胆酸7α-脱氢反应中，需要连续不断地再生辅因子NAD+。我们采用绿色、经济且清洁的空气/烟酰胺辅酶氧化酶(NOX)组合策略，并结合氧传递效率大幅度强化的微通道反应器技术，成功革新了代价昂贵、三废很多的丙酮酸/乳酸脱氢酶或丙酮/异丙醇脱氢酶等NAD+再生方法, 使得酶的单耗减少7倍，辅酶利用率提高10倍，时空产率比常规搅拌式反应器提高96倍，这为多酶级联绿色制造化学难合成的复杂功能分子提供了典型范例，对熊去氧胆酸生产工艺的革新可能产生颠覆性影响。