基于理性设计的多聚磷酸激酶构建体外酶法ATP再生系统

In vitro multi-enzymatic is independent on metabolism regulation, free of by-products, and the target products are easily to be separated and purified. However, multi-enzymatic often require cofactors. ATP is the energy currency of biological, biochemical reactions, and is the key energy carrier. Due to few studies on ATP regeneration system, current research is more focusing on NAD(P)H-dependent enzyme catalysis and co-immobilized multiple enzyme in order to improve the catalytic efficiency. Polyphosphate kinase may utilize polyphosphate to regenerate ATP, its reaction conditions are simple, easy to recycle, thus shows great potential. However, the reported polyphosphate kinase majority could only use long-chain polyphosphate, but long chain poly-phosphate is difficult to synthesis and very expensive. Polyphosphate is a linear amorphous molecule, and short-chain polyphosphate has the same high-energy phosphate bonds, but extremely cheap. The project aims to study polyphosphate kinase substrate recognition, binding mechanism, and based on its catalytic mechanism, through the rational design to engineer a polyphosphate kinase, in order to build a new ADP binding pocket, so that it is able to take advantage of short-chain polyphosphate to regenerate ATP. Our preliminary studies show that a designed enzyme was capable to catalyze the short-chain polyphosphate to regenerate ATP. The project will further research theoretical mechanism, to promote further rational design of enzymes, to meet the requirements of industrial application, expanding research and application of in vitro multi-enzyme catalytic system.

体外多酶催化不受代谢调控影响，且没有副产物，易于分离纯化。多酶催化往往需要辅因子。ATP是生物的能量货币，是生物化学反应提供能量的关键载体。由于ATP再生体系研究较少，目前多酶催化主要集中在NAD(P)H相关的研究及多酶共固定以提高催化效率。多聚磷酸激酶可利用聚磷酸再生ATP，反应条件简单，易于回收再利用，极具应用潜力。但目前已报道的多聚磷酸激酶基本只能利用长链的聚磷酸，而长链聚磷酸合成困难，价格昂贵。聚磷酸是线状无定型分子，短链的聚磷酸也具有相同的高能磷酸键，但极其廉价。本项目旨在研究多聚磷酸激酶的底物识别、结合机制，基于多聚磷酸激酶的催化原理，通过理想设计，改造多聚磷酸激酶，构建全新ADP结合口袋，使其可利用短链聚磷酸再生ATP。前期研究工作表明，设计改造的酶可以催化短链聚磷酸再生ATP。项目将深入理论研究，进一步合理改造，设计符合工业要求的酶，拓展体外多酶催化体系的研究及应用。

体外多酶催化是近几年的酶工程的研究热点，多酶系统可以实现多步反应在温和条件下合成复杂产物。相比全细胞依靠代谢途径的催化转化，体外催化不受转录调控影响，具有转化效率高，副产物少，没有细胞代谢物，产物单一，易于分离纯化等优点，可用于合成，检测等。但多酶催化研究当中，体外ATP再生体系需要使用昂贵的高聚磷酸作为供体，缺乏应用前景。本课题以多聚磷酸激酶（PPK）为研究对象，采用分子模拟手段指导酶的理性设计与实验方法相结合，研究多聚磷酸激酶催化机理、底物识别机制，聚磷酸应与ADP同时结合在不同的底物口袋，以进行磷酸基团转移。但发现短链聚磷酸由于分子量小，过于灵活，会与ADP竞争天然酶同一底物口袋，因此另辟蹊径，保留此口袋以结合短链聚磷酸，并在磷酸基团转移活性中心对称位置设计构建另一适配ADP的底物口袋，改造多聚磷酸激酶，突破了聚磷酸链长限制，使其具有以廉价的短链聚磷酸（三聚磷酸、四聚磷酸）为底物的能力，构建了高效的ATP再生体系，为多酶催化提供能量动力，实现了高效ATP依赖型多酶催化体系的构建。在以四聚磷酸和ADP分子作为能量供给底物构建的多酶催化体系中，催化合成了相应的多酶体系催化产物谷胱甘肽（38.79 mM）和葡萄糖六磷酸（87.35 mM）。一方面，本研究揭示了多聚磷酸激酶的底物识别、抑制、催化机理，阐明了多聚磷酸激酶结构与ADP、多聚磷酸的相互作用规律，预测构建了全新ADP底物口袋，进而理性设计改造多聚磷酸激酶，具有一定的理论意义；另一方面，本研究的酶法ATP再生系统是一个通用的方法，能够拓展到其它需要ATP的多酶催化体系当中，为需要消耗ATP的多酶催化体系的构建和机理研究提供廉价、高效、通用的ATP再生系统，具有一定的应用价值。