miRNA在HNF-4α诱导肝癌干细胞分化过程中的表达和功能研究

原发性肝癌术后复发率高，对放化疗不敏感，诱导肝癌细胞，特别是诱导与肝癌的发生、转移、复发和耐药性产生密切相关的肝癌干细胞（LCSC）的分化有望解决肝癌治疗的难题。作为一种小分子调控型RNA，miRNA已经被证明广泛参与调控干细胞的分化和肿瘤细胞的去分化过程，而miRNA在LCSC分化过程中表达和功能尚无相关研究报道。本研究拟通过流式细胞技术从肝癌细胞系分选出LCSC,利用促肝细胞分化的转录因子HNF-4α诱导其分化，miRNA芯片技术检测分析LCSC分化前后miRNA的表达谱及差异，筛选出表达显著变化的miRNA，生物信息学分析这些miRNA基因组上游启动子区转录因子结合元件以及其可能调控的与LCSC分化密切相关的靶基因，利用报告基因和Western Blot等方法研究调控这些miRNA表达变化的转录机制，确认miRNA所调控的靶基因，以期阐明miRNA在LCSC分化过程中的表达和功能。

原发性肝癌术后复发率高，对放化疗不敏感，诱导肝癌细胞，特别是诱导与肝癌的发生、转移、复发和耐药性产生密切相关的肝癌干细胞的分化有望解决肝癌治疗的难题。作为一种小分子调控型RNA，microRNA（miRNA）已经被证明广泛参与调控干细胞的分化和肿瘤细胞的去分化过程，而miRNA 在肝癌干细胞形成和分化过程中表达和功能尚无相关研究报道。本研究首先利用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系分选获得表皮细胞粘附分子阳性（EpCAM+）肝癌干细胞，利用肝细胞核因子4α （HNF-4α）诱导其分化。由于过表达HNF-4α后肝癌干细胞并未出现明显分化，而鉴于肝癌干细胞分化与肝癌细胞去分化之间是相对可逆性转化过程，我们进一步尝试建立肝癌细胞去分化形成肝癌干细胞的模型。利用肝癌细胞球培养法我们成功建立了人Huh7肝癌细胞向EpCAM+肝癌干细胞的去分化转化模型；在此基础上，我们利用miRNA芯片、miRNA定量PCR和Northern Blot方法筛选并验证获得了一批在肝癌细胞向肝癌干细胞转化过程中表达显著变化的miRNA。其中miR-383、miR-27b-5p、miR-149-5p等miRNA在肝癌干细胞转化形成过程中表达显著上调；miR-1 、miR-125b-3p和miR-23a-5p等miRNA表达则显著下调。随后，我们对部分在肝癌干细胞转化形成过程中表达变化的miRNA展开了进一步功能研究。我们发现在肝癌干细胞转化形成过程中显著下调的miR-1能够通过调控内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）基因表达抑制肝癌细胞增殖；此外，miR-1还能够抑制凋亡抑制因子5（Apoptosis inhibitor-5, API-5）和BAG4基因表达而促进肝癌细胞凋亡，共同发挥肝癌抑制性功能。而另一种在肝癌干细胞转化形成过程中表达上调的 miR-27b-5p则能够诱导肝癌细胞中肿瘤干细胞相关基因的表达，并可能通过抑制抑癌基因FOXO1的表达促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆集落形成等肿瘤生物学活性。我们的研究获得了部分在Huh7人肝癌细胞向EpCAM+肝癌干细胞转化过程中表达改变的miRNA，并初步阐明了部分miRNA的调控功能和机制。这些研究结果表明miRNA在肝癌细胞向肝癌干细胞转化形成过程发挥了重要调控功能，也为以肝癌干细胞为靶点的细胞分子治疗提供了新的理论基础和实验依据。