淫羊藿次苷II通过抑制钙结合蛋白S100A16发挥抗骨质疏松作用的机制研究

Icariside II is the main active metabolite of icariin which has the function of suppressing osteoporosis, but the molecular mechanism remains unclear. In our previous studies, we have demonstrated that S100A16 was able to promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into lipocytes instead of osteoblast. Our recent data showed that ① icariside II improved osteoporosis effectively compared with icariin; ② icariside II markedly downregulated the expression of S100A16; ③ overexpression of SA00A16 impaired the promoting osteoblastic differentiation of BMSCs induced by icariside II; ④ Wnt/β-catenin signalling pathway was activated by icariside II and inhibition of this pathway attenuated the downregulation of S100A16 caused by icariside II. Therefore, we postulate that icariside II may promote the osteogenic differentiation of BMSCs and inhibit the adipogenic differentiation by downregulation of the expression of S100A16, which is caused by the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway. We will test this hypothesis by construction of the osteoporosis mouse model and separation of primary cells, as well as combination with microCT and luciferase reporter assays, etc. Results of this project will reveal the roles and molecular mechanisms of icariside II in suppression of osteoporosis,thus provide the theoretical and experimental basis for the popularization of treatment of osteoporosis using traditional Chinese medicine.

淫羊藿次苷II是中医治疗骨质疏松症的常用中药淫羊藿在体内的主要代谢产物之一，具有抗骨质疏松作用，但药效及具体机制不明确。我们已证明：钙结合蛋白S100A16抑制骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化促进其成脂分化。我们还发现：淫羊藿次苷II能够 ①比淫羊藿更有效地改善小鼠骨质疏松；②强烈下调S100A16蛋白表达；③诱导BMSCs成骨分化，高表达S100A16削弱这一作用；④激活Wnt/β-Catenin通路，抑制此通路削弱淫羊藿次苷II对S100A16的下调作用。由此，我们推测：淫羊藿次苷II通过抑制S100A16促进BMSCs成骨分化抑制其成脂分化进而发挥抗骨质疏松作用。本研究拟通过骨质疏松小鼠模型和原代细胞模型，结合CT、成骨成脂分化、报告基因分析等手段对此假说进行验证。本项目的研究结果将揭示淫羊藿治疗骨质疏松的有效成分及其分子机制，为中药治疗骨质疏松的全球性推广提供理论和实验研究。

我们严格执行原研究计划，完成项目计划书中制定的研究内容，而且增加了课题研究的广度和深度，为该项目的后续研究奠定坚实的理论和实验基础。本研究结果如下：.研究开始之初，我们首先建立并鉴定细胞模型（原代小鼠骨髓间充质干细胞），以此为模型，筛选出合适的淫羊藿次苷II作用浓度和时间，开展后续实验。同时，成功构建骨质疏松症模型，并灌胃给药，micro-CT结果显示，淫羊藿次苷II能够改善雌激素缺乏模型小鼠的骨量减少，且改善小鼠雌激素缺乏诱导的骨髓腔内脂质堆积。严谨起见，骨髓间充质干细胞实验再一次验证这一结果。结合前期研究，思考淫羊藿次苷II这一作用的机制。S100A16是一种小分子钙结合蛋白，研究中我们再一次采用S100A16转基因小鼠和基因敲除小鼠证实S100A16能够抑制骨髓间充质干细胞成骨分化促进成脂分化。而体内、外实验结果显示淫羊藿次苷II抑制S100A16表达。这些的结果是否提示，S100A16参与调控淫羊藿次苷II抗骨质疏松作用？体外骨髓间充质干细胞模型实验结果显示，高表达S100A16能够抑制淫羊藿次苷Ⅱ发挥促进BMSCs成骨分化的作用，而低表达S100A16呈相反作用。但对成脂作用正好相反，即高表达S100A16能够减弱淫羊藿次苷Ⅱ的抑制脂滴聚集作用，低表达S100A16呈相反作用。动物模型实验进一步证实这一结果。淫羊藿次苷Ⅱ/S100A16调控成骨成脂的分子机制如何？细胞免疫荧光和western blot实验提示，Wnt/β-catenin信号通路参与淫羊藿次苷Ⅱ通过S100A16调控骨质代谢的这一过程，但详细的机制仍需深入研究。.后续实验中，我们会继续深入淫羊藿次苷II和S100A16对Wnt/β-catenin通路中各分子的影响，包括蛋白和mRNA表达水平、活化水平、以及在细胞中的定位。以及淫羊藿次苷II代谢过程。