基于ITRAQ蛋白测试结果发掘鲢低氧胁迫功能基因

低氧胁迫对鲢的生存造成严重影响，然而我们对此发生的遗传机制了解甚少，因此开展对鲢的低氧胁迫下基因资源的发掘及其相互之间的调控研究十分必要。本团队利用ITRAQ蛋白检测技术得到鲢低氧胁迫下肝脏中差异表达的蛋白221个，其中表达差异超过1.2倍的候选蛋白基因8个，其中2个为已知蛋白基因，分别是烯醇化酶和肌酸激酶，另外6个是未知功能蛋白基因。本项目拟对这8个蛋白基因（特别是6个未知功能基因）开展较为系统的研究：利用低氧处理活体和重组基因转化肝脏细胞系，探索侯选基因与鲢低氧胁迫的关系及在低氧胁迫下的表达模式；利用酵母双杂交实验揭示侯选基因在低氧胁迫的相互作用及调控关系。通过本项目实施，一方面可鉴定出与低氧胁迫相关的功能基因，尤其是功能未知基因，阐述功能基因与低氧胁迫的关系，初步了解鲢应对低氧胁迫的分子机制，另一方面为鲢耐低氧新品种选育提供指重要的蛋白（基因）指标。

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是我国淡水养殖的主要鱼类，广泛分布于我国的淡水水域。鲢的耐低氧能力差，性燥，易翻塘，在长期养殖过程中造成了巨大损失。因此，研究鲢低氧胁迫下的应激反应机制对鲢新品种的选育具有非常重要的意义。本研究利用ITRAQ测试结果中选择出的候选基因对低氧胁迫的应激性进行了扩增验证。.在本研究中，我们扩增得到了11个低氧胁迫相关基因，其中包括低氧诱导因子，克隆获得鲢低氧诱导因子HIF-1α，胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1，胰岛素样生长因子 IGF-I，热激蛋白HSP70、 HSC70， 鲢骨架蛋白α-actin，α-tubulin，TUB84，TUBA2以及鲢线粒体ATP酶β亚基，γ亚基，δ亚基等基因的cDNA序列，运用荧光定量RT-PCR ,免疫组织化学等等方法研究其表达特征，分析其生物学功能。结果表明，在肝脏中，HIF-1α在低氧胁迫后表达量明显增高，并保持增加的趋势直至最后。而在鳃中，HIF-1α低氧胁迫3小时后，表达量开始增加，到12小时达到最大值后逐渐减少到正常对照组的表达水平; 低氧胁迫过程中HSP70 mRNA在心脏中呈现出先升高后降低的表达趋势，在脑，脾脏和肾中呈现出升高的表达趋势。低氧下IGFBP-1 转录水平在肝脏中明显上升α-tubulin基因在低氧胁迫下鲢肌肉中显著升高，之后又显著降低至对照组水平。α-actin在低氧下的表达量与对照组相比有显著降低，在鲢心脏、脑和肾脏组织中，α-actin基因在整个低氧胁迫后期表达量与对照组相比均显著降低，在肝脏中略有升高，而脾脏在急性低氧胁迫期间，未检测到α-actin存在显著性变化。TUB84在肝脏、肾、肌肉中表达明显上升，在心脏中表达显著下降，而TUBA2在肝脏、脾脏和肾中表达明显升高，在心脏中出现显著下降，脑和肌肉中则无明显变化。随着溶氧的降低，心脏、脑、肝、脾和肌肉组织中F1-β mRNA的表达呈先升高后降低的趋势，在脑、肝和肌肉中γ基因的表达呈现先升高后降低的趋势，F1-δ mRNA的表达在心脏中呈现持续下降的趋势，在脑、肝、脾和肌肉中的表达先呈现上调现象，随后表达下调与对照组无显著差异。这些结果表明，我们研究的这些基因均与鲢低氧胁迫下的自我适应机制相关。