与马铃薯Y病毒HC-Pro蛋白互作的桃蚜口针受体蛋白的筛选鉴定

Potato virus Y(PVY) which cause serious hazard to potato, tobacco and other crops is transmitted by aphids in a nonpersistent manner. Helper Component Proteinase(HC-Pro) encoded by PVY can interact with receptor proteins of aphid stylet in order to help the virons finish horizontal transmission. However, the research on receptor proteins progressed at a slow pace not only because of the low protein content, but also owing to the weak interaction with HC-Pro. Consequently, it is of great scientific significance to identify the receptor proteins of aphids’stylet. Surface Plasmon Resonance (SPR) which has been widely used in the research and indentification of interaction proteins is an effect method to study weak interaction between proteins. Based on our preliminary studies on Myzus persicae stylet obtaining method and the RNA silencing system, this project intends to screen and identify the receptor proteins interacting with HC-Pro encoded by PVY in Myzus persicae stylet, utilizes SPR and yeast two hybrid system. Then further verification will be done through RNA silencing and antibody blocking technology. The scientific significance of this project will help to understand the underlying mechanism of nonpersistent manner.

马铃薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）由蚜虫以非持久性传毒方式传播，在马铃薯、烟草等作物上造成严重危害。研究发现，PVY通过HC-Pro与蚜虫口针中的受体蛋白特异性互作，实现病毒粒子的水平传播，但由于口针受体蛋白含量低、与病毒互作弱等原因，相关方面研究进展缓慢。因此，鉴定蚜虫口针的受体蛋白具有重要的科学意义。表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术是近年发展的一种筛选弱互作蛋白的有效方法，已广泛应用于互作蛋白的研究及筛选鉴定。申请人前期建立了桃蚜口针的快速挑取方法和RNAi验证体系，在此基础上，本研究拟以桃蚜-PVY为研究对象，利用SPR技术与酵母双杂交技术相结合筛选鉴定桃蚜口针受体蛋白，通过RNAi和抗体封闭进一步确认受体蛋白。研究结果对解析非持久性传毒机制具有重要的科学意义。

本研究以HC-Pro蛋白为诱饵蛋白，通过酵母双杂交和表面等离子共振技术（SPR）并结合转录组分析，以期筛选并鉴定桃蚜口针上与马铃薯Y病毒（PVY）互作相关蛋白。主要研究结果如下：.利用酵母双杂交技术最终筛选到37个可能互作的ORF；利用SPR结果中筛选得到具有跨膜结构或者定位在膜上的蛋白36个。根据生物信息学分析，选取可能性最高的7个蛋白，扩增其完整的ORF，进行酵母双杂交验证，最终发现3个互作的蛋白。选择互作最强的ORF35蛋白进行体外GST pull-down验证和烟草细胞内双分子荧光互补验证，均未观察到互作信号。通过抗体饲喂发现并未对获毒产生影响。由于ORF35是一个表皮蛋白，其活性需要几丁质的参与，纯化的ORF35蛋白由于缺少几丁质可能导致构型不正确，因此影响了抗体的制备及后续的验证结果。.转录组数据分析，发现了对桃蚜繁殖力具有调控作用的Gustavus蛋白，并且证实，取食PVY侵染的烟草会影响Gustavus基因的表达量。该结果为控制桃蚜繁殖力，降低种群密度提供了新的靶标位点，为防控桃蚜成灾提供新的理论和方法。此外，通过转录组分析，发掘了一批可能与桃蚜翅形成和飞行相关的基因，其生物学功能正在进一步验证中。