羊口疮病毒ORFV047入侵蛋白互作受体筛选、鉴定及功能研究

Vaccinia virus (VACV) entry into the host cells that involved in many viral-encoded proteins. VACV L1 protein is indispensable for cell entry and membrane fusion independent of glycosaminoglycan (GAG). Orf virus (ORFV) is the causative agent of Orf that causes an severe zoonosis disease. Genomics analysis has indicated that ORFV ORFV047 is the homolog of VACA L1. However, the role of the ORFV047 protein in the viral entry and infection remains largely unknown. In this project, knocked down of GAG receptor by RNAi in target cell will be blocked by recombinant ORFV047 protein. Then the susceptibility of treated cells for ORFV infection will be evaluated. After the role of ORFV047 in viral entry has been confirmed, ORFV047 protein itself will be used as the prey try to “fish out” the receptor from cDNA library of susceptible cells by yeast-two-hybrid technique. Then interactions between ORFV047 protein and identified receptor will be evaluated by following methods: co-immunoprecipitation,surface plasmon resonance, immunohistochemistry, receptor blockage and RNAi and so on. This project will provide the molecular details of the mechanism of ORFV entry the cell, as well as develop a novel vaccine or targeted drug for ORFV disease.

痘病毒在入侵和感染宿主细胞的过程中涉及多种自身编码蛋白的参与，其中L1蛋白是痘苗病毒入侵和膜融合的、不依赖于细胞表面GAG的必需蛋白。羊口疮病毒（ORFV）是危害严重的人兽共患痘病毒之一，其具有高度的嗜上皮组织性。分析发现ORFV 047编码痘苗病毒L1的同系物，但有关ORFV047在ORFV入侵宿主细胞的功能和分子机制尚不清楚。本项目拟通过ORFV感染可溶性ORFV047蛋白处理的经RNAi敲降GAG细胞，分析病毒对细胞的感染性变化，验证其在ORFV入侵细胞中的作用；进一步以ORFV047蛋白为诱饵，应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的受体，继而应用免疫共沉淀、等离子表面共振、免疫组化、受体阻断、RNAi等方法鉴定与ORFV047蛋白相互作用的受体及其功能，明确ORFV047蛋白与其受体相互作用关系，为解析ORFV的入侵机制提供理论依据，也为靶向抗病毒药物和疫苗的研发奠定基础。

羊口疮病毒（Orf virus, ORFV），是痘病毒科、副痘病毒属的成员，可引起人、绵羊、山羊以及多种野生动物接触性感染。羊口疮是目前广泛流行于我国，且危害较严重的人兽共患痘病毒病。然而，由于痘病毒结构复杂、编码蛋白种类繁多，限制了人们对ORFV入侵相关机理的研究。.痘苗病毒（VACV）是痘病毒研究的模式病毒， VACV 的L1R蛋白含有250AA，N端包含有2个豆蔻酰化位点（GlyxxxSer/Thr），本研究发现，ORFV047编码VACV L1蛋白的同系物，在ORFV基因组上ORF047命名为L1R，其编码的蛋白含有245AA，含有3个豆蔻酰化位点。 从分离的甘肃株羊口疮病毒基因组DNA中克隆ORF047基因全长，全长为735bp，与VACV基因组中的L1R在核苷酸水平的同源性为56.9%，氨基酸水平的同源性为59.8%，在N端的前20个AA中的二者的同源性达70%，存在相似的结构。后将已获得ORF047基因利用酵母表达系统和原核表达系统表达全长或者部分片段，用ORFV感染ORFV047重组蛋白处理的羊睾丸细胞，不同时间分析病毒对细胞感染性变化，但是ORFV-047在病毒入侵宿主细胞中的作用不明显；共聚焦显微镜分析ORFV047在细胞内的表达主要是位于胞浆中；成功的构建了膜体系羊睾丸文库，利用构建的pBT-N-ORF047诱饵载体作为诱饵蛋白，从构建的文库中筛选到与ORF047其相互作用的三个蛋白，分别为stress-associated endoplasmic reticulum protein（SERP1），Poly(A) binding protein cytoplasmic (PABPC4) ，Ferritin light chain(FLC)，随后从羊睾丸细胞cDNA中克隆获得PABPC4、 FLC 、SERP1三个基因的全长序列，分别为1983bp、528bp、201bp；本研究中将这三个基因和目的基因构建过表达载体，免疫共沉淀技术验证发现ORF047与这3个基因都有相互作用。本项目利用酵母双杂交技术从宿主的羊睾丸膜体系文库中筛选到与其相互作用的3个宿主蛋白，虽然不是直接的受体，但是SERP1、PABPC4是与病毒的增殖、转录相关，这揭示了ORF047是与 ORFV的入侵有一定的相关性，这对今后进一步的深入探讨ORFV入侵机理提供了一定的基础。