马铃薯-病毒亲和与非亲和互作中差异表达基因的筛选、克隆和鉴定

病毒导致的病害和种薯"退化"已经成为我国马铃薯产业进一步发展的主要限制因子之一。由于病毒在细胞水平上侵染寄主，防治困难，传统的病毒防治方法成本高、效率低。而研究寄主与病毒的互作机制、改良品种抗性则是最经济有效的解决途径。本研究从马铃薯品种"Shepody"对病毒PVY和PVA分别产生亲和与非亲和反应的表现型差异入手，借助高效特异的差异显示技术和高通量的基因表达分析技术，在同一寄主中比较分析两类互作反应背后的基因表达差异，筛选参与马铃薯-病毒互作的重要抗病毒相关基因和寄主感病因子，并通过基因沉默和超量表达技术研究和验证这些关键基因在亲和与非亲和互作中的功能。研究结果将有助于揭示马铃薯-病毒互作的基因表达谱和涉及的主要代谢及信号传导途径，并为深入了解马铃薯抗病毒的分子机制和病毒的侵染策略奠定基础，同时也为马铃薯病毒抗性的遗传改良和病毒防治工作提供更加安全有效的策略。

植物与病毒的互作在植病互作领域中研究相对较少，但对揭示植物抗病毒机制和病毒侵染植物的策略有重要的理论意义，尤其是在如马铃薯这样受病毒危害较严重的无性繁殖的作物中，对改良病毒抗性和制定病毒防治策略都有积极的实践意义。马铃薯品种Shepody嫁接接种两种同为Potyvirus属病毒PVY和PVA，分别产生亲和与非亲和互作反应，为研究马铃薯-病毒互作提供了一个良好的平台。本研究利用退火特异性引物为基础的差异显示技术对亲和与非亲和马铃薯-病毒互作中基因表达差异进行了比较分析，在相同的寄主中筛选出50个差异表达的PCR片段，对这些差异产物进行了克隆和测序，测序结果在NCBI和TIGR数据库中进行检索分析，共获得67个代表不同基因的非重复序列片段，功能分析结果显示，抗病防御和逆境胁迫相关基因，占约30%，其余基因可能参与了代谢相关、蛋白质的转运及加工、信号传导、转录相关调控等过程，表明病毒侵染诱导马铃薯寄主产生了多层次的复杂反应。这些差异表达基因（differential expressed genes, DEGs）中，除核糖体RNA基因以及长度不足100 bp的片段以外，59个DEGs和两种目标病毒均根据它们的序列设计了相应的捕获探针和报告探针，用NanoString表达分析技术在一个样品中同时分析它们在不同侵染时间的表达模式。结果显示，59个DEGs中有43个在病毒接种后发生了明显的上调或下调表达，其中包括仅在非亲和互作中差异表达的2个DEGs，分别DEG34-3（乙烯应答因子）以及DEG65（不依赖Ca2+的磷脂酶A2）。而仅在亲和互作条件下差异表达的则多达19个，其中包括DEG26-3（泛素载体蛋白）、DEG59-2（homeobox转录因子），DEG14（多酚氧化酶），DEG22-1（放氧复合体）等。为了进行深入的功能鉴定，对其中两个重要候选基因，编码基因沉默复合体（RISC）组分Argonaute蛋白的DEG21-1以及编码分子伴侣DnaJ-like蛋白的DEG60-1，进行了全长cDNA克隆，并构建了超量和干涉载体。进一步的遗传转化工作正在进行中，它将揭示这些基因在马铃薯-病毒互作中等功能。