发形霞水母毒素心血管活性组分定向分离及其作用机理研究

水母蜇伤可致系列中毒，循环功能损伤是致死的主要原因。水母毒素具有强烈而广泛的生物活性，但毒素成分和作用机理未明。我们从多个层面证明了发形霞水母毒素的心脏毒性，锁定了分子量27kDa和29kDa的目标分子，并发现Ca2+超载在毒素的心肌细胞毒性中起重要作用。因此，本课题选择我国东南沿海代表性有毒水母发形霞水母为研究对象，以触手提取物为粗毒样品，通过液相色谱并结合活性监测来定向分离心血管活性蛋白；通过飞行时间质谱分析、设计特异引物从全长序列cDNA文库（或经RACE方法）获取活性蛋白全长基因并推导其氨基酸序列，利用生物信息学方法进行结构和功能预测；通过分子克隆表达该活性蛋白，纯化后进行心脏及心肌细胞毒性评价；分析CICR与PKA两通路共同诱导的Ca2+超载在毒素蛋白心脏毒性中的作用，阐明其心脏毒性的细胞与分子机制。既可获得具有强烈心血管活性的蛋白组分，又可为水母蜇伤的防护与治疗提供直接指导。

水母蜇伤是最常见的海洋生物致伤，蜇伤患者除局部红肿、瘙痒、疼痛之外，严重者可出现系列全身中毒症状，其中循环功能损伤是致死的主要原因。水母毒素具有强烈而广泛的生物活性，但毒素成分和作用机理未明。本课题选择我国东南海域代表性有毒水母发形霞水母为研究对象，以触手提取物为粗毒样品，开展了毒素分离、重组表达以及作用机理等系列研究。首先，利用水母毒素溶血组分和心血管组分最适pH值的不同，成功将心血管组分与溶血组分分离开来，表明水母毒素的心血管活性组分是独立于溶血组分而存在的，水母毒素的心血管损伤效应不单纯是溶血作用的继发效应。其次，证明发形霞水母毒素在较高剂量时具有直接的心脏和心肌损伤效应。在离体心脏模型水母毒素可以引起冠脉收缩和心功能指标下降，直接损伤心脏；Ca2+通道阻断剂硝苯地平和维拉帕米可以显著减轻水母毒素对心功能的抑制，提示水母毒素的心血管毒性作用机制可能与L型钙通道有关。第三，发现水母毒素在较低剂量时具有导致机体多脏器损伤的延迟效应。水母毒素在较高剂量(540 μg/kg)时可致大鼠急性循环功能衰竭，2 h内快速死亡；较低剂量(≤ 360 μg/kg)时，动物存活时间延长至10 h以上，但心、肺、肝、肾等重要脏器均出现剂量依赖性损伤，因而我们提出了水母毒素延迟中毒综合征的概念。第四，证明 CICR信号通路过度激活是水母毒素导致急性心功能异常的重要机制之一。发现水母毒素的心肌细胞毒性可能与过度激活CICR信号通路引起胞浆Ca2+超载有关，L-型Ca2+通道阻断剂地尔硫卓在心肌细胞、离体心脏与整体动物水平均明显拮抗水母毒素的心肌细胞毒性及其引起的急性心功能异常。第五，发现水母毒素具有明显的蛋白酶活性，膜保护剂PEG 4000和金属蛋白酶抑制剂BB-94联合应用能有效改善水母毒素引起的循环功能损伤，提高急性中毒小鼠的生存率，提示蛋白酶类与水母毒素的心血管毒性密切相关。第六，基于我们前期建立的水母触手组织cDNA文库和转录组文库，筛选到虾红素样金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等系列蛋白酶相关序列，选择合适载体重组表达获得具有活性的虾红素样金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶分子。总之，本课题结合分离纯化和重组表达，获得了水母毒素中心血管毒性密切相关的系列蛋白酶分子，同时明确了CICR 与PKA两通路共同诱导的Ca2+超载在毒素蛋白心脏毒性中的作用。