CICR与PKA通路协同诱导Ca2+超载在发形霞水母触手提取物心脏毒性中的作用机制

水母蜇伤是最常见的海洋生物伤，循环衰竭是水母蜇伤致死的主要原因，但水母毒素的心血管毒性机制尚不清楚，也无特异的治疗药物。我们已证实全心衰竭是发形霞水母触手提取物（tentacle-only extract，TOE）导致大鼠死亡的主要原因，前期结果初步提示CICR与PKA通路协同诱导Ca2+超载可能是TOE心脏毒性的基本机制。本课题拟通过直接测定、抑制剂干预等手段从正、反两方面研究CICR与PKA两通路在TOE心脏毒性中的作用并分析其协同效应，以阐明其细胞与分子机制；单独或联合应用CICR与PKA通路抑制剂，分析其对心肌细胞存活率、离体心脏和整体心功能、心肌酶的影响，筛选出能够预防或治疗水母蜇伤心脏毒性的特效药物或药物复方。前期实验观察到TOE在损伤心肌之前出现短暂兴奋过程，拟进一步分析TOE对PKA通路的活化作用与其潜在强心效应之间的关系，为从水母毒素中分离强心活性组分提供理论和实验依据。

水母蜇伤是最常见的海洋生物伤，急性循环衰竭是水母蜇伤致死的主要原因，但水母毒素的心脏毒性机制尚不清楚，也无特异的治疗药物。我们在前期已证实全心衰竭是发形霞水母（Cyanea capillata）触手提取物（tentacle extract，TE）导致大鼠死亡的主要原因的基础上，我们研究发现：TE在较低剂量（≤360 μg/kg i.v.）下可以引起温和（20~30 mmHg）、较长持续时间（6~8 h）的升血压作用，推测其可能与PKA通路的过度激活有关。细胞外无Ca2+环境可以显著抑制TE引起的乳鼠心肌细胞Ca2+超载并改善其对心肌细胞存活率的抑制；采用各种类型离子通道进行筛选实验发现Ca2+通道阻断剂具有明显地拮抗TE心肌细胞毒性的作用，并在离体心脏和整体动物水平（地尔硫卓）都得到了的验证，从而证实了细胞外Ca2+内流引起的CICR通路过度激活在TE心脏毒性中发挥重要作用的观点。我们研究还发现TE显著升高心肌细胞内cAMP浓度与PKA活力，并且可以被β1受体阻断剂抑制；细胞外无Ca2+条件下，PKA抑制剂H89与RyR2抑制剂Ryanodine可以明显拮抗TE心肌细胞毒性；TE增加CREB，cTnI等PKA底物蛋白的磷酸化水平。这些研究结果表明PKA通路过度激活在水母毒素心脏毒性中发挥重要作用，同时这也提示水母毒素中可能存在活性强烈的β1受体新型肽类配体分子，通过过度激活β1受体及其下游信号通路而发挥特异的心脏损伤效应。在此基础上，我们进一步构建了C. capillata触手组织的转录组及蛋白质组参考数据库，并进行了相应的生物信息学分析；挑选部分水母触手提组织中潜在的活性蛋白如GDI、IE6等进行了大量的水母活性蛋白重组表达研究，积累了丰富的水母毒素相关活性蛋白活性表达的经验。这些工作为下一步获取水母毒素中β1受体新型肽类配体分子并研究其对β1受体-cAMP-PKA通路的激活效应准备了条件。