发形霞水母（Cyanea capillata）触手转录组分析及其重要活性因子的克隆表达与功能研究

Jellyfish, an abundant marine life, has the advantage of diverse biological activities. Many studies have proved jellyfish to be a potential resource pool for marine drugs which need in-depth research and development. In our previous study, by high-throughput sequencing, we have obtained the transcriptome of the tentacle of Cyanea capillata, a representative toxic jellyfish in Southeast China Sea. A preliminary analysis has shown that there are a large number of coding sequences for many possible bioactive factors including antioxidants, metalloproteases. On this basis, this study aims to make a further in-depth and integrated analysis of this transcriptome, understand the transcription profiling and the relationship between the transcripts,which can provide basic essential data for following screening, identification and study of jellyfish toxin and other important bioactive components. In addition, on the basis of previous studies on antioxidation and protein hydrolysis effects of tentacle-only extract from the Cyanea capillata, we will focus on the sequences in the transcriptome coding antioxidants and an astacin-like metalloprotease family in this study. By RACE-PCR, pichia pastoris yeast expression system and protein purification, we will obtain the target proteins and make a study on their activity detection and functional characterization, which help to further understand the material bases of antioxidation and protein hydrolysis activities of Cyanea capillata, and provide scientific foundation for development of its bioactive components.

海洋中数量丰富的水母产生的生物活性物质具有多样性的特点，是水母中毒复杂性的重要基础，也是潜在的海洋药物资源宝库。本课题组前期通过高通量测序，获得了我国东南海域代表性有毒水母--发形霞水母触手转录组并进行了初步分析，发现其中存在大量包括抗氧化、金属蛋白酶等在内的可能与水母毒素生物学活性相关的编码序列。在此基础上，本项目拟对该转录组信息进行深入分析，明确触手转录谱及其转录产物之间关系，为挖掘、筛选及深入研究水母毒素蛋白及其他活性因子提供基础数据；同时，结合前期触手提取物抗氧化、蛋白水解等活性研究结果，重点关注转录组中抗氧化、astacin-like金属蛋白酶家族的编码序列，通过RACE-PCR、毕赤酵母表达系统表达及纯化等手段获得目标活性蛋白，开展其相关活性和功能研究，为阐明发形霞水母抗氧化、毒素胞外基质降解及扩散等作用的物质基础和机制提供科学依据。

本课题通过高通量测序，获得了发形霞水母Cyanea capillata触手转录组。筛选水母毒素及其他重要因子编码序列；对水母抗氧化蛋白、astacin-like金属蛋白酶进行了活性研究。首先，对转录组进行了深入分析，共有21,357条Unigene获得功能注释。分别有6,657和6,202条Unigene获得了GO、COG功能分类注释, 涉及物质及能量代谢、转录调控及防御反应等诸多生理生化过程; 共有13,663条Unigene序列获得了KEGG Pathway注释信息，这些结果将有助于挖掘水母某些重要功能相关的新基因。其次，对毒素和其他重要活性因子相关序列进行了筛选与分析。发现一系列典型毒素蛋白家族，包括金属蛋白酶、磷脂酶类、丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂类，可能与毒素水解活性、毒素扩散、组织出血等作用相关。发现大量可能编码水母毒素的序列，包括CfTX-like、VEGF、ACE-like、ECE-1-like、histamine-releasing factor、plancitoxin-1-like等，为阐明水母蛰伤机制奠定基础。此外，还发现了数条编码神经退行性疾病如亨廷顿舞蹈症、帕金森病和阿尔茨海默病相关序列，这是从水母中首次发现的神经退行性疾病相关基因。第三，首次从水母中克隆表达获得两种抗氧化活性蛋白。获得了编码发形霞水母硫氧还蛋白和过氧化物还原酶的全长cDNA序列，构建重组质粒CcTrx1-pET24a和CcPrx4-pET24a，表达纯化获得高浓度、高纯度的重组蛋白。rCcTrx1对二硫键具有较强的还原能力，rCcPrx4能够迅速稳定清除以H2O2为主的活性氧自由基，rCcTrx1与rCcPrx4都具有保护质粒DNA抵抗体外氧化损伤的作用。第四，成功构建了三条编码astacin-like金属蛋白酶（CALP1、CALP2和CALP3）的重组表达载体，诱导表达获得融合蛋白，摸索分析了CALP蛋白可溶表达及包涵体表达的最优条件。发现复性后的CALP融合蛋白、刺丝囊毒素和触手提取物均具有降解明胶、纤维蛋白原和纤连蛋白的活性，为阐明金属蛋白酶在水母毒素发挥毒性效应中的作用奠定了基础。