以L12/L10相互作用为新型抗结核/肠杆菌药物靶标的确认与先导物发现研究

In previous work, a yeast two-hybrid system was established to screen the inhibitor of L12 and L10 interaction and found 10 compounds and 5 strains. After consideration, compounds T766 and T054 were chosen for further study on model, inhibition of protein expression, protein interaction blocking and anti-bacteria activity, and confirmed L12 and L10 interaction could be used as target to screen anti anti-tuberculosis drugs primely. In this project, we will to study the activity of GTPase and blockage of L12 and L10 interaction in vivo and analyse other positive compounds activity to get better antibuberculosis lead compounds and determine the L12 and L10 interaction can be used as anti-tuberculosis drug target. In addition,L12and L10 interaction is conserved in bacteria, but its homology is difference, so this project intends to deepen the use of L12 and L10 interaction as target to screen other pathogenic bacteria antibiotic. Gram-negative basillus has been the main pathogenic bacteria of clinical bacterial infection and its drug resistance problems intensified. Because L12 and L10 gene have high homology in gram negative basillius, this project is planned to construct yeast two-hybrid system of E.coli L12-L10 interaction and screen lead compounds with activity of anti-Gram-negative bacillus.

在前期工作中，以L12与L10相互作用的酵母双杂交系统为模型筛选得到多个化合物，并对其中的T766和T054化合物在模型、蛋白合成抑制、体外蛋白相互作用阻断及抗菌活性等方面进行深入，基本证实L12与L10相互作用能够作为靶点筛选抗结核药物。本项目将进一步研究体外GTP酶活性和菌体细胞内相互作用阻断的验证以及其他阳性化合物的活性分析，以期能够得到具有更好的抗结核活性的先导化合物和确定L12与L10相互作用能够成为抗结核药物筛选靶点。此外L12与L10相互作用及其功能在细菌中是保守的，但是同源性差异很大，因此本项目拟深化L12与L10相互作用在其他致病菌抗生素筛选中的应用。革兰氏阴性杆菌已经成为临床细菌感染的主要病原菌并且其耐药问题愈演愈烈，基于革兰氏阴性杆菌L12与L10基因同源性极高，本项目拟构建大肠杆菌的L12与L10相互作用的酵母双杂交模型用以筛选抗革兰氏阴性杆菌的先导化合物。

结核菌与革兰氏阴性肠杆菌的耐药是目前抗感染治疗中面临的严重问题，筛选、发现和验证抗结核和抗革兰氏阴性肠杆菌的药物分子靶标，从靶标上进行突破，获得新型抗结核和抗肠杆菌药物是目前抗感染药物研究的热点之一。本项目是青年面上连续项目，计划在上一个基金的基础上进行以L12/L10相互作用为靶标的抗结核与抗革兰氏阴性菌药物的筛选及深入机制研究。通过GTP酶测活以及更多阳性化合物获得等方法对结核杆菌L12与L10相互作用作为抗结核药物筛选靶点的深入研究，以证实构建的模型能用于长期高通量筛选及活性评价。另外评价大肠杆菌L12与L10相互作用成为抗革兰氏阴性杆菌药物筛选靶点的可行性及先导化合物的发现研究。建立大肠杆菌L12与L10相互作用的酵母双杂交系统筛选方法，并通过体内外活性测定等确认阳性化合物能够通过L12与L10相互作用阻断来发挥其抗菌活性。通过4年的工作，已经基本完成研究计划内容。抗结核药物研究方面获得了1个模型上有活性的阳性化合物6581F4，1个有抗结核活性的阳性化合物。成功建立了大肠杆菌L12与L10相互作用的酵母双杂交系统筛选方法，得到了2个具有模型和抗大肠杆菌活性的阳性候选药物IMB-84和IMB-87，这两个化合物在模型上对大肠杆菌L12和L10蛋白相互作用均有抑制活性。通过SPR 和GST pull-down实验、体外蛋白表达抑制实验和GTP酶抑制实验证明两个活性化合物能够在体外阻断L12和L10蛋白的相互作用。过表达实验结果说明化合物的体内抑制活性可能与L12-L10相互作用阻断相关。两个化合物对大肠杆菌标准株（2-4μg/ml）和若干临床耐药菌均具有较强的杀伤性（2-16μg/ml）。相关研究结果投稿一篇APSB，目前已经修回，另外投稿一篇Scitific Report，目前正在审稿中。同时获得专利授权一项，申请一项。本研究首次对大肠杆菌L12/L10相互作用作为药物筛选靶标进行评价，认为该靶标有可能成为抗革兰氏阴性菌筛选的靶标，但是同时也发现酵母本身的特点以及药物多靶标的现象使得靶标筛选在抗菌药物筛选中存在局限性，表型筛选和靶标筛选的结合能够大大提高药物筛选的效率。