以酪氨酰tRNA合成酶为靶点的新型抗结核药物的理性化筛选和先导化合物的发现

结核病尤其是耐多药结核病的流行严重威胁着公众的健康和生命安全。氨酰-tRNA合成酶通过催化氨酰-tRNA的合成，在蛋白质生物合成中起着至关重要的作用，有可能成为抗菌药物的新靶点。本课题拟以结核分枝杆菌生长所必须的，且与真核细胞无相似性的酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）作为靶点，利用原核表达体系克隆表达结核分枝杆菌TyrRS，并分离纯化TyrRS蛋白，采用液闪计数法和NADH比色法两种方法测活，建立酶水平的高通量药物筛选模型。以与结核分枝杆菌近缘的耻垢分枝杆菌作为检定菌，对样品库进行初筛，得到初筛阳性化合物。同时以天然产物数据库和商业化合物数据库为数据源，采用计算机虚拟筛选，获得潜在的结核分枝杆菌TyrRS抑制剂候选库。利用结核分枝杆菌TyrRS抑制剂筛选模型进行复筛，并进行深入活性评价，以期获得以TyrRS为靶点、低毒、选择性强和不交叉耐药的新型抗结核药物候选物。

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种严重危害人类健康的传染病，近年来随着多重耐药（MDR-TB）和广泛耐药结核菌（XDR-TB）的大量出现，曾被有效控制的结核病有卷土重来之势。因此发现高效低毒的新型抗结核药物刻不容缓。.　　氨酰-tRNA合成酶在蛋白质生物合成中起着至关重要的作用。酪氨酰tRNA合成酶（TyrRS）为结核分枝杆菌生长所必需，因此有可能成为抗结核药物的新靶标。.　　本项目运用了计算机-分子-细胞水平三位一体的抗结核药物理性化筛选策略，采用虚拟筛选、耻垢分枝杆菌初筛和酪氨酰tRNA合成酶复筛相结合的筛选方法，以期获得以TyrRS为靶点的新型抗结核先导物。我们首先以MTB TyrRS为靶，利用计算机辅助药物设计软件对样品库中的65000个化合物进行了虚拟筛选，选取了打分排名靠前的1500个结构作为候选化合物，然后用耻垢分枝杆菌初筛模型，对这些化合物进行了细胞水平的初筛，得到220个初筛阳性化合物。随后利用原核表达系统在大肠杆菌中表达了MTB TyrRS蛋白，采用同位素法、钼酸铵孔雀绿游离磷酸检测法、NADH比色法建立了酶水平的MTB TyrRS抑制剂高通量筛选模型，并利用该模型进行复筛，得到12个复筛阳性化合物，测定了其体外抗结核分枝杆菌的活性。结果表明，阳性化合物T097和T136能够显著抑制结核标准株的生长，MIC值分别为0.125g/ml和4.777g/ml，其抗结核活性为首次报道。此外，它们对临床分离的耐药株表现出良好抑制活性，MIC值为0.5g/ml ~ 5g/ml之间。MTT实验表明二者的细胞毒性很小。体外酶水平实验表明，T097和T136对MTB TyrRS表现出中等抑制作用，分子对接实验证实其能与酶活性位点的氨基酸残基通过氢键和范德华力相互作用。阳性化合物Z130、Z134在酶水平表现出了较好的抑制作用，其IC50值分别为为6.04μM和0.398μM。MTT结果显示Z130的毒性在50~100μM之间，Z134的毒性大于100μM。以T097和T136两个化合物作为先导化合物，分别设计、合成了两个系列的衍生物，并进行了抗结核活性测试，初步得到了两类化合物构效关系。这两类化合物有可能开发成为有自主知识产权的高效、低毒、选择性强和不交叉耐药的新型抗结核药物候选物。