可自组装的重组VHb：拮抗氧浓度波动和缓解胞内氧化压力

氧在基因工程产品生产过程中起关键作用，以大肠杆菌为例，菌体内没有较好的应对氧浓度上升和氧化压力增大的机制和途径，我们前期工作发现脂结合可以调整VHb的氧化－还原能力，据此我们认为，可以通过调整宿主菌内VHb的脂结合状态，应对氧浓度变化和氧化压力增大对菌体的影响。拟采用基因工程方法在大肠杆菌内引入编码重组VHb的基因，该蛋白是由VHb、多聚甘氨酸手臂（Gly）n以及可淀粉样化标签（我们前期研究中发现的可淀粉样化片段β2m21－31）构成，该标签能使重组蛋白在宿主菌内形成偏好脂结合的聚集体。进行通过改变（Gly）n中n值，调整宿主细胞内重组蛋白聚集体形成能力的研究，探索重组大肠杆菌在不同氧浓度条件下，从环境中俘获氧、存储缓释氧、拮抗氧浓度上升和氧化压力增大等能力的变化规律，为解决氧对基因工程产品生产的限制提供新思路，为构建基于非共价相互作用的具有生物功能的胞内自组装复合体奠定理论及实验基础。

氧在基因工程产品生产过程中起到关键作用，以大肠杆菌为例，菌体内没有较好的应对氧浓度波动和氧化压力变化的机制和途径。本项目中，我们通过构建可自组装的透明颤菌血红蛋白，调节该重组蛋白在宿主胞内的分布，从而影响重组蛋白在宿主体内的生物功能，增强基因工程宿主大肠杆菌拮抗氧浓度和氧化压力变化的能力。.研究中我们构建了可自组装的透明颤菌血红蛋白，通过调节连接肽手臂和可淀粉样化标签的大小，以宿主菌表达基因工程产品的能力及拮抗发酵条件中氧浓度变化的能力为筛选指标，寻找到了目的可组装化透明颤菌血红蛋白（amyloid unit Vitreoscilla hemoglobin, AuVHb）。.AuVHb可以明显提升氧化压力过高时宿主菌的生存率，当发酵环境中氧化压力相当于10mM过氧化氢时，含AuVHb宿主的生存率是原始宿主菌的100倍左右；该蛋白的存在也可以明显增加宿主菌在氧浓度不足情况下的载氧能力，相同条件下宿主菌载氧量是原始宿主菌原始菌的1.75倍；限制外源性氧输入的情况下，含AuVHb宿主的氧缓释时间为原始宿主菌原始菌的1.4倍；外源氧供给充足情况下，含AuVHb宿主的氧上传递参数是原始宿主菌的1.77倍。.以对宿主菌生长生存无害的绿色荧光蛋白的发酵生产为例，24小时发酵时含AuVHb宿主的菌体量是原始菌的1.23倍，含AuVHb宿主的单位菌表达GFPuv蛋白量是原始宿主菌的1.34倍，含AuVHb宿主的总蛋白表达量是原始宿主菌的1.66倍。.以对宿主菌生长生存有害的精氨酸酶的发酵生产为例，随着宿主胞内精氨酸酶的表达，宿主发酵体系中精氨酸被大量降解为尿素和鸟氨酸，随着精氨酸的降解，发酵体系中的宿主菌的生长和增值速度受到影响，甚至出现宿主菌的死亡，精氨酸耗竭引发的细胞自噬是精氨酸酶作为抗癌制剂的主要分子机制。含AuVHb宿主在发酵产生精氨酸酶时菌体量是原始宿主菌的1.16倍，表达精氨酸酶蛋白量是原始宿主菌的1.09倍。.以氨基酸发酵生产为例，含uVHb宿主在发酵精氨酸进行菌种活化时菌体量是原始宿主菌的2.15倍，含AuVHb的宿主菌在进行色氨酸发酵时单位菌体色氨酸产生量是原始宿主菌的2.99倍（氧补给充足）和4.84倍（氧补给不足）。.综上所述，本项目中设计并筛选了可自组装透明颤菌血红蛋白，该重组蛋白可以极大程度上提高基因工程产品生产的产能和效率。