Mtb云南临床分离株基因型及其B细胞免疫应答的研究

Tuberculosis is a severe infectious disease that is harmful to human. There is a high morbidity of tuberculosis in Yunnan because of the special geographical position, large floating population, human immunodeficiency virus infection, and so on. However, the study on tuberculosis is insufficient to compare with other area of China. We have know that there is a complicated geonotype in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and that different Mtb strain has different virulence and maybe induce different immune response type. The studies about Mtb show that anti-Mtb immunity is mainly innate immuntiy and Th1-mediated cellular immunity. Resently researches have shown that B cell mediated immune response carry out a protecting role in Mtb infection. However, it is unclear that of the response, subpopulation and differentiation of B cell in tuberculosis. In this project, the BALB/c mice will be infected with the dominant genotype of Mtb (Beijing family)in China. We will collect the serum, peritoneal cells, spleen, bone marrow, lymph node, lung, liver and kidney from the infectious mice both in the early stage and later period of the infection. Then the B cell response, B cell subsets, B cell differentiation and fuction, Th1/Th2 reactive cells, the numbers of Mtb and the pathology in the organs will be investigated by flow cytometry, culture in vitro, ELISA, bacterium culture and pathological technique. According to the results, we will understand the B cell mediated immune response stimulated by the Mtb, explore the immune response on the influence of pathological progression, and analyze the balance between humoral and cellular immune response on the influence of disease. The mice infected with H37Rv will be as a control of the research. The results will provide the theory basis for diagnosis, treatment, preparing new vaccines and making control measures of tuberculosis.

结核是危害人类健康的重大传染病，云南由于地理位置特殊、流动人口大、HIV感染严重等原因，结核感染率高，但结核在云南的研究相对滞后。Mtb的基因型复杂，有研究已经提示不同Mtb菌株具有不同的毒力及免疫应答方式。资料表明，抗结核免疫主要是固有免疫及Th1介导的细胞免疫，但最近的研究已经显示了B细胞应答在结核中的保护作用，而我们对B细胞在结核病中应答、亚群变化、分化等不清楚。本项目拟采用在中国广泛流行的Mtb北京基因型菌株感染BALB/c鼠，取不同感染阶段的小鼠血清、腹腔细胞、脾脏细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞、肺、肝、肾，运用流式细胞术、体外培养、ELISA等对结核病早期及晚期的B细胞应答、B细胞亚群、B细胞亚群分化及功能、T细胞的Th1/Th2反应模式进行研究，并测定结核不同阶段的小鼠荷菌量及小鼠脏器的组织病理变化，分析细胞免疫与体液免疫相互调节及平衡对结核病理进展及结局的影响。同时采用国际标准株H37Rv作为对照，比较Mtb基因型菌株与H37Rv引起B细胞免疫应答的差异，为临床结核病的诊断、治疗、疫苗研究及防控措施的制定提供依据。

结核是危害人类健康的重大传染病。本研究建立了H37Ra和Mtb临床分离株BALB/c鼠感染模型，直到感染后12W，均能从脏器分离培养到感染菌；发现结核感染小鼠后，虽能引起脏器的炎症反应，但不能引起类似人类结核的病理变化。我们取不同感染阶段的小鼠血清、腹腔细胞、脾脏细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞，运用流式细胞术、ELISA等对结核病早期及晚期的B细胞应答、B细胞亚群、B细胞分化和功能、T细胞的Th1/Th2反应进行研究，并比较H37Rv与Mtb临床分离株引起B细胞免疫应答的差异。研究结果显示结核感染时，早期仅有IgM增高，而晚期IgG、IgM和IgA水平均增高，且随着病程增加而增加。减毒株H37Ra对抗体产生作用的影响似乎与Mtb毒株不同，在实验时间内未观察到IgG的升高，是否因为毒株较减毒株H37Ra具有更强的免疫原性需要进一步的研究。研究结果还显示结核感染影响了成熟B细胞主要亚群的分布，感染时B细胞在外周免疫器官中重新分配，总B细胞在脾脏中降低，而在淋巴结中升高；FO B细胞升高，MZ B细胞降低；在实验时间内，B1细胞虽未表现异常，但B1b细胞降低，B1a细胞在感染早期升高；研究结果显示针对非蛋白类抗原反应的MZ B细胞及B1细胞在结核感染中前者降低而后者基本无变化，Mtb菌体成分与其他病原体的最大不同就是含脂类量大，即非蛋白类抗原多，而我们的研究显示这两类B细胞在感染8W内不升高且MZ B细胞反而降低，B细胞亚群分布的变化在结核感染中的作用有待进一步研究。另外，结果显示，结核感染能影响B细胞的分化发育，促使B细胞向成熟细胞分化，发育早期的B细胞（pro-B、immature B及T1 B细胞）减少，成熟B细胞增多，并能促使活化B细胞及记忆性细胞增多，使机体更有利于抗结核的感染。此外，我们的研究还显示H37Ra及Mtb感染早期的小鼠脾CD3+T细胞降低、脾CD4+T细胞降低、CD8+T细胞升高，晚期恢复至正常；对小鼠淋巴结CD3+T细胞及T细胞亚群分布无影响；Mtb感染晚期，出现Th1反应而未见明显Th2反应。初步的研究显示了H37Ra及Mtb临床分离株在对B细胞亚群分布、B细胞发育分化及T细胞亚群分布的影响中差异不明显，这与以往了解的H37Ra仅为毒力降低，但保留免疫原性的结论是一致的，也说明了Mtb大理临床分离株免疫原性与结核分枝杆菌免疫原性大致相同。