通过定向进化和半理性设计扩展酰基转移酶DutH底物谱并探索其机理

Anthracyclines are one of the most effective anticancer drugs for chemotherapy. Sabarubicin, the third-generation antitumor anthracycline, shows a stronger inhibition on cancer cells and a milder cardiotoxicity, whereas the myelosuppression is the main toxicity. It was reported that the disaccharide side chain is crucial to the bioactivity of sabarubicin. In order to further improve the efficacy of sabarubicin, we will try to modify its bioactive disaccharide side chain by using an ACP shuttle-type acyltransferase DutH. In Streptomyces minoensis, the anthracycline POK-MD1, which has a high similarity to sabarubicin, is predicted to be the natural substrate for DutH. In preliminary study, DutH transferred the methyltriketide to the 4″-OH of the deoxysugar side chain of POK-MD1 to yield dutomycin. We also found the sabarubicin can be modified by DutH. In this project, using POK-MD1 and sabarubicin as substrate, we will firstly characterize the function and substrate spectrum of DutH. Secondly, we will identify the crucial amino acids of DutH, which determine the recognition and binding sites to substrates. Thirdly, in order to expand the substrate spectrum, the genetic modifications on substrate-binding pocket of DutH will be performed, which is based on directed evolution and semi-rational design. We will also try to investigate on the mechanism of substrate spectrum expansion of DutH.

蒽环类药物是目前治疗癌症最有效的的化疗药物之一。作为第三代蒽环类药物的莎巴比星具有更高的抗癌活性以及更温和的心脏毒性，但仍然存在骨髓抑制为主的细胞毒性。因为糖基侧链对于莎巴比星的活性至关重要，所以申请人将利用酰基转移酶DutH修饰其糖基侧链以改进药效。源自美浓链霉菌的DutH的天然底物预测是与莎巴比星具有高度结构相似性的POK-MD1。本项目组在预实验中鉴定了DutH的功能为催化甲基三聚酮与POK-MD1糖基侧链的C-4″通过酯键相连接，并且发现DutH也可以催化修饰莎巴比星。因此本课题希望以POK-MD1和莎巴比星为底物研究：（1）鉴定DutH的功能及底物谱等酶学特性；（2）找到DutH中识别和结合底物的重要氨基酸位点；（3）通过定向进化和半理性设计对于DutH底物口袋进行分子改造以扩大其底物谱，并探索其机理。

蒽环类药物是一类临床广泛使用的抗癌药物，是目前最有效的化疗药物之一。酰基转移酶DutH可以针对莎巴比星和POK-MD1的C-4″羟基的修饰，具有在不破坏关键C-3″基团的情况下定点创造化学多样性的潜力。因此，我们针对DutH的酶活和底物选择性开展研究。揭示酰基转移酶DutH和PokM3功能，预测DutH蛋白结构，底物结合位点的氨基酸序列。分析突变DutH底物结合关键氨基酸改变与底物结构之间的关系。比较dutomycin及其衍生物的抗癌活性，解析其结构和药效的关系。我们首次验证了DutH和PoKM3的功能，并且体外合成了新化合物XR836。我们还发现了dutomycin和其衍生物SW91虽然在结构上高度类似，但是在抗癌活性上却有很大差异。在研究酰基转移酶DutH的活性中心的结构发现存在关键的Asp-His对结构，通过低能障的氢键起到了稳定底物和催化中心结构的作用。同时，我们意外的发现，在另外一种特殊的金属β-内酰胺酶型硫酯酶（MβL-TE）的活性中心也存在多对Asp-His对结构。表明这种结构存在活性是基于反应中是否存在水的参与，分别参与催化酯化/酯交换反应和水解反应。这一特性让DutH和MβL-TE在水溶液中都表现出水解酮酰基-S-酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）的硫酯键的作用。因此，展开了对MβL-TE水解硫酯键的活性的研究。在酿酒酵母中重构endocrocin和emodin的高效合成途径。构建组合表达文库，筛选活性最高的酶的组合。通过代谢工程改造宿主细胞碳流合成通路，获得了高产工程菌，并进一步优化发酵条件，取得了较高的产量。分析了HyTE的蛋白结构，鉴定重要非催化不保守氨基酸，并设计高效的工程酶。我们首次在酿酒酵母中异源重构了endocrocin和emodin的高效合成途径，产量为当时报道的最高水平。鉴定了高活性的MβL-TE，来自Hypoxylon sp. EC38的HyTE。在此基础上，我们进一步确定了A19/E75为决定HyTE酶活性的重要非催化不保守氨基酸，通过半理性设计了高效的工程酶，将其活性提高了28.4倍，具有工业应用的潜力。