O-甘露糖基转移酶底物特异性研究和黏蛋白型O-糖基化对其底物位点选择的影响

O-Mannosylation is an important protein posttranslational modification process, which is initiated by O-Mannosyltransferases (POMT) in endoplasmic reticulum (ER) to add mannose onto selected Thr or Ser residues. This glycotransferase preferred the domains rich in Ser and Thr, which are also substrate regions for another complex O-glycosylation type, mucin-type or O-GalNAc glycosylation. This Gogi-initiated glycosylation was found to be relocated in ER in a serial of cancer cells recently, which might affect O-Mannosylation. Several severe diseases have been identified to be associated with the loss of O-Mannose glycans from O-Mannosylated proteins. For example, the loss of O-Mannose glycans on α-Dystroglycan is related with muscular dystrophy and the development of neural system. This project aims to probe substrate specificities of human POMT recombinantly expressed in mammalian cells in vitro by using synthetic peptides or E. coli-expressed recombinant proteins derived from natural substrates. Furthermore, this project is going to express O-GalNAc transferases in ER and thus investigate the influence of O-GalNAc glycosylation on the addition of Mannose onto α-Dystroglycan and other O-Mannosylated substrates, as well as the interactions of these two O-glycosylation types via Glycoproteomics-based analyses.

O-甘露糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰途径，由O-甘露糖基转移酶在内质网中起始，多发生在富含丝氨酸和苏氨酸的区域。另一种发生于高尔基体的黏蛋白型O-糖基化（O-GalNAc糖基化）有相似的位点选择区域，而且在一些肿瘤细胞中发现O-GalNAc转移酶会反转运到内质网中，对O-甘露糖途径产生潜在影响。O-甘露糖基化底物肌营养不良糖蛋白α（α-Dystroglycan）上糖链的缺失与肌营养不良症和神经系统的发育异常密切相关。本项目拟在哺乳动物细胞中重组表达人O-甘露糖基转移酶，以合成肽或大肠杆菌重组蛋白作为底物，利用体外反应研究O-甘露糖基转移酶的底物选择特异性。同时，拟在人肾胚细胞系Hek293T内质网中表达O-GalNAc糖基转移酶，分析α-Dystroglycan上O-甘露糖位点的改变，并使用糖组学方法识别被影响的O-甘露糖基化底物以探索两种不同的O-糖基化途径之间的相互作用。

糖基化修饰作为蛋白翻译后修饰的重要途径，对细胞生长、分化、代谢、识别和免疫反应及神经系统等起调节作用。O-甘露糖基化（O-Man）是一种主要的O-连接糖基化修饰途径，由O-甘露糖基转移酶PMT在内质网中起始，多发生在富含丝氨酸和苏氨酸的区域。细菌、真菌和动物中都发现了O-Man糖基化途径, 但是目前对PMT底物特异性的研究还存在很大空白。本项目首先在毕赤酵母中对不同物种来源PMT的底物特异性进行了探索，并通过体外实验检测了其他O-糖基化途径（O-GalNAc）起始酶GalNAc-T对PMT糖基化位点的利用情况，同时尝试在缺少O-GalNAc糖基化途径的酵母中构建人O-GalNAc糖蛋白的生产平台、以及扩展研究两种细菌糖基化修饰方法等。我们的研究发现不同来源的PMT的底物识别是保守的，不同物种来源的O-Man底物可以被其他来源的PMT所识别，因此巴斯德毕赤酵母可以作为一个平台来检测不同PMT的底物特异性。该结果还为在酵母中表达异源的特别是人源化的O-Man糖蛋白提供理论基础。同时在体外证实，GalNAc-Ts可以催化PMT底物糖蛋白上的O-Man位点，从而初步揭示了O-GalNAc糖基化和O-Man糖基化底物的重叠。以此为基础，作为本项目的延伸，我们尝试在毕赤酵母中构建人O-GalNAc糖蛋白生产体系，为衍生新课题的进行奠定了基础。为了与酵母糖蛋白生产平台相补充，我们扩展了其他两种细菌糖基化修饰策略的研究，新型N-糖基转移酶（NGTs）的发现和性质鉴定为制备具有天然或非天然N-糖链结构的治疗性糖肽或糖蛋白提供了新的工具，而表达痢疾志贺氏菌1型O-PS的重组大肠杆菌在制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌糖抗原中具有非常重要的应用价值。本项目为在酵母中表达异源特别是人源化的O-糖蛋白药物以及两种细菌糖基化修饰方法的推广应用提供理论支持。