通过定向进化提高GalE对自由单糖的催化效率并探索其机理

UDP-Glucose (galactose) 4-epimerase is encoded by galE gene, it catalysis the 4-epimerization of UDP-glucose and UDP-galactose. Due to the 4-epimerization of GalE rely on the activation of UDP group, it not suitable for industrial production of valuable rare monosaccharides. We find several galE gene from different kinds of organism, plan to construct the mutation gene library by error-prone PCR and DNA shuffling methods, then screen out the GalE mutation which could catalysis the free monosaccharides effectively by high-throughput screening system based on galactose operon and green fluorescent protein GFP signal. By the analysis of the GalE mutants, we can also further illustrate the interaction between active site and monosaccharide and the catalytic mechanism. Galactose is the precursor of an important functional sweetener tagatose. Therefore, the investigation of this project is important in the development of enzyme engineering and valuable in production of rare sugar.

UDP-葡萄糖（半乳糖）4-差向异构酶由galE基因编码，该酶能够催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之间的差向异构化反应。由于该酶的活性依赖于UDP基团的存在,使它不适合用于工业上有价值的稀有单糖的生产。我们找到一些不同来源的galE基因，计划通过易错PCR和DNA改组相结合的手段，得到galE基因的突变文库，并通过非常有效的基于半乳糖操纵子和绿色荧光蛋白GFP的高通量筛选体系，筛选到能够直接高效催化自由葡萄糖和半乳糖转化的葡萄糖4-差向异构酶突变体。通过对GalE突变体的突变位点进行分析，我们也能更深入地阐释GalE活性中心与自由单糖的结合方式与催化机理。半乳糖是一种重要的功能性甜味剂塔格糖的生产原料。因此，该项目的研究具对酶工程学的发展具有重要意义，在稀有糖的生产上有重要应用价值。

该项目计划通过定向进化提高GalE对自由单糖的催化效率，并探索其分子机理。我们成功构建了基于GFP的高通量筛选体系，并构建了galE基因的突变文库进行了筛选，很遗憾，最终并没能筛选到高效催化自由葡萄糖转化成半乳糖的GalE突变体。我们及时调整方法并同时开展了另一项目的研究：在体外酶反应体系中将底物D-葡萄糖通过中间产物丙酮酸转化为L-乳酸。我们将纯化或部分纯化的酶和辅酶以及底物D-葡萄糖在单个容器中进行反应，终产物L-乳酸的得率最高能达到90%。并且整个反应体系只需要五种酶，是目前体外反应体系中用酶数量最少的。整个反应体系NADH自平衡,且不需要额外的ATP。我们的研究结果对丙酮酸衍生物的合成具有重要意义，同时还促进体外酶反应体系技术的发展。.. 考虑到个人研究背景及研究兴趣，职业发展前景等原因，本人在基金执行期间改变了工作单位和研究领域。2018年1月至今，本人就职于天津医科大学基础医学院，主要研究非自噬和非小细胞肺癌（NSCLC）相关蛋白的作用机制。.我们研究了肺癌细胞中的非受体酪氨酸激酶SYK(L)抑制SNAL2的转录的机制。SYK是一种非受体酪氨酸激酶，它在不同的细胞类型中执行不同的功能，可能是原癌基因也可能是癌基因。研究中，我们发现SYK(L)能够在细胞核内结合YY1蛋白，它们的结合通过失活SNAI2抑制了EMT的活性。EMT在肿瘤的发生、转移以及肿瘤治疗的抵抗中扮演着重要角色。SYK（L）对EMT的调控意味着肺癌治疗中它可能是新的药物靶点。. 我们的另一项研究研究是关于用AAV作为shRNA的载体敲低NUPR1（p8）对肺癌细胞的影响。研究结果表明，敲低p8的同时用三氟啦嗪（TFP）处理，会引起裸鼠中异源移植的A549肺癌细胞的早属性衰亡，这为AAV用于肺癌的临床治疗打下理论基础。