miR-145/PAK4/LIMK1调控通路介导结直肠癌肝转移的机制研究

Colorectal cancer is one of the most common malignancy with a 3rd highest occurance rate in the world. Liver metastasis was found in more than 50% of all colorectal cancer patients.In our previous study of miRNAs in colorectal cancer,through miRNA microarray,we found that the expression level of miR-145 in liver metastastic tissue,primary cancer,and para-tumoral region,increased accordingly,while the expression level of PAK4 and LIMK1 decreased accordingly. It was also demonstrated that miR-145 could regulate expression level of PAK4 by binding to 3' UTR of PAK4 mRNA via luciferase assay. After inhibition of endogenous PAK4 expression by lentivirus-mediated gene silencing technique,the proliferative capability of colorectal cancer cells was suppressed significantly. All our previous data suggested that PAK4 plays an important role in colorectal cancer progression and metastasis. In this project, we plan to investigate the downstream signaling pathway of PAK4 via molecular biology, cellular biology and in vivo animal models. We will investigate the mechanism by which miR-145/PAK4/LIMK1 regulates liver metastasis of colon cancer, and evaluate whether PAK4 can be regarded as a bio-marker for colorectal cancer by analyzing the relationship between the expression level of PAK4 and the prognosis of colorectal cancer patients.

结直肠癌发病率居恶性肿瘤的第三位,尽管近年来诊治水平有了很大提高，但是肝转移的发生率依然高达50%以上，是患者致死的主要原因。申请者比较了结直肠癌的癌旁、原发灶及肝转移灶，发现miR-145表达依次降低，而PAK4和LIMK1表达依次升高；进一步研究揭示miR-145结合到PAK4 mRNA 的3'非翻译区并下调PAK4的表达，但并不直接调控LIMK1的表达。RNAi敲减结直肠癌细胞的内源性PAK4后，LIMK1表达下调且增殖和侵袭力显著下降，提示miR-145/PAK4/LIMK1调控通路在结直肠癌的肝转移过程中起到重要作用。本项目拟通过分子生物学、细胞生物学及实验动物模型，深入研究miR-145/PAK4/LIMK1通路调控结直肠癌肝转移的具体分子机制，结合临床组织标本确定这一通路中的关键分子，分析其与临床病理指标及预后的关系，评估其作为结直肠癌肝转移分子标记物及治疗靶点的可行性。

研究背景：据国家卫计委最新统计，国内每天大约有一万人诊断为肿瘤。其中结直肠癌是发病率和死亡率均居前五位的恶性肿瘤。特别地，我国结直肠癌患者中，直肠癌特别是低位直肠癌占有较大比例。虽然新辅助治疗可以提高一部分患者的保肛率，但是结直肠癌的术后局部复发和远处转移仍然是困扰进一步提高其五年生存率的关键症结。临床上主要以血清CEA及影像学检查作为结直肠癌术后的随访监测工具，但由于特异性及敏感性的问题，血清CEA存在一些不足，而影像学检查亦有发现时较为迟缓的问题。因此，亟需新的生物学标志物作为临床应用的补充。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的一类非编码小分子RNA，通过结合到靶基因mRNA 的3‘非翻译区（3’ untranslated region，3‘UTR），导致靶基因的mRNA 的降解或者抑制靶基因mRNA 的翻译。由此通过对下游功能基因的转录后mRNA水平的调控发挥其生物学功能。miRNA 在体内参与了广泛的生物学过程，尤其近年来，miRNA 的调控与肿瘤的发生、发展的关系得到了越来越重要的揭示。.主要研究内容及结果：1.qRT-PCR及Western Blotting分别检测miR-145及PAK4在8株结直肠癌细胞株中的表达，发现在DLD-1细胞株有较高表达水平的miR-145，其PAK4表达反而较低；与此相反，miR-145在SW1116和HCT116俩株细胞里表达较低，其PAK4却具有相对较高水平。2.因此我们选择在miR-145表达水平较低的SW1116和HCT116俩株细胞里进行过表达miR-145，以进行进一步研究。同时构建了靶向PAK4的shRNA进行细胞实验。发现过表达miR-145，显著抑制了SW1116和HCT116俩株细胞PAK4的表达，这一结果为shPAK4所复现。3.transwell实验证实了miR-145过表达显著抑制了SW1116及HCT116俩株细胞的迁移和侵袭能力，这一结果亦为shPAK4所复现。4.Western Blotting证实miR-145或shPAK4明显抑制了p-LIMK1及p-cofilin的表达。5.结合TCGA数据分析，进行Kapaln-Meier检验，发现具有较高PAK4表达水平的结直肠癌患者，具有更差的预后。.综上，以上结果证实miR-145通过靶向PAK4通路抑制结直肠癌的侵袭转移。