番茄B-box锌指蛋白BBX18基因负向调控抗旱的分子机理研究

Understanding the mechanism of drought-tolerance and producing germplasm of drought tolerance are important in plant research. BBX (B-box) zinc finger protein is a novel type of transcription factor, and its function was rarely reported. Here, we isolated a drought response BBX gene screened from previous drought tolerant tomato microarray experiments, named BBX18. We performed functional analysis of BBX18 through overexpression and RNAi in tomato. We found that BBX18 RNAi tomatoes could significantly improve the tolerance to drought stress, and its overexpression lines behave sensitive under drought condition compare to wild types. But it is not clear on the molecular mechanism. In this project, we plan to use ChIP-Seq to screen the specific DNA binding sequence of BBX18, and then to confirm them by the EMSA validation. The interaction protein with BBX18 will be screened by the yeast two-hybrid system, and the interaction between the BBX18 and the positive proteins will be confirmed by BiFC analysis. Interesting, we found that AAP (Ascorbate peroxidase, EC1.11.1.11) and AAO (Ascorbate oxidase, EC 1.10.3.3) can bind to the BBX18, therefore, the redox state of ascorbic acid will be determined. The functions of candidate genes were analyzed through over-expression and knockdown transgenic research. Then the phenotypes related to drought tolerance will be analyzed to illuminate the function of the candidate genes. The research work will shed more light on molecular mechanism of BBX18 gene in the regulation of plant drought tolerance signal transduction patway in the tomato.

揭示植物抗旱机制和创造抗旱新种质具有重要理论意义和应用价值。BBX（B-box）锌指蛋白是植物中发现的一类新的转录因子，在番茄中其功能还未见报道。前期我们分离得到的1个在番茄抗旱中有重要功能的基因BBX18，发现抑制表达BBX18可以显著的提高番茄的抗旱性，相反，超量表达使其对干旱更加敏感，但是其作用机制还不清楚。本项目拟利用ChIP-Seq筛选出BBX18的DNA特异结合序列，EMSA验证后鉴别出其作用的靶标基因；通过酵母双杂交和BiFC，鉴别出BBX18蛋白的互作蛋白；根据初步筛选出来的互作蛋白AAP和AAO，测定相关抗坏血酸氧化还原状态，确定BBX18影响的抗坏血酸代谢途径；上述相关结果再结合转录组数据进行分析，筛选关键基因进行转基因（超量和沉默）功能分析，确定由BBX18基因调控的相关基因在番茄抗旱中的生物学功能，阐明BBX18调控番茄抗旱的分子机制。

非生物胁迫对作物产量和品质的不利影响已成为全球气候变化的主要挑战。干旱是严重影响全球农业的主要非生物逆境。通过基因工程的方法提高植物的抗旱性是目前最有效的方法之一。因此，分离出新的抗旱基因，解析其分子机制，提高植物的抗旱性具有重要的研究意义。本项目以模式植物番茄为研究对象，解析一个新的转录因子BBX18负向调控抗旱的分子机制。首先对BBX18转基因植株的抗旱性进行鉴定和生理生化分析，并完成了RNA-seq转录组分析，对关键基因进行了验证；获得了CaMV 35S:: BBX18-HA的转基因植株，利用ChIP-Seq筛选出其DNA特异结合序列，并且对关键的基因和顺式作用元件进行了ChIP-qPCR和EMSA的验证；通过IP-MS和酵母双杂筛选出了该基因的互作蛋白，并且完成了BiFC和Co-IP的验证；完成了其互作蛋白如APX1，AAO，BBX5和靶基因BBX3，BBX24的转基因功能验证，获得了优良的抗旱番茄种质；对关键基因APX1进行了抗旱性鉴定和生理生化分析，并且和BBX18敲除植株进行了基因聚合，研究了基因之间的上下游调控关系；BBX18通过直接和APX1互作，并结合APX1的启动子序列从转录水平调控该基因的表达，从而提高番茄的抗旱性；此外，BBX18和Solute transport相关蛋白的互作也给基因的分子机制深入研究提供了线索；本项目创制番茄抗旱种质材料6份，明确了BBX18通过APX1调控抗旱的分子机理，为植物的抗旱性育种提供了材料和理论参考。项目执行以来，共培养研究生7人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人；有2名硕士研究生进入到博士研究生阶段学习。共发表第一标注本项目资助的论文6篇，其中SCI论文5篇。