番茄干旱响应基因HyPRP的功能分析与作用机理解析

A HyPRP encodes a protein containing proline-rich domain and eight-cysteine motif (8CM). Its expression was suppressed under various abiotic stresses, such as drought, high-salinity, cold, heat and oxidation, and treatment of phytohormone abscisic acid in tomato. Functional analysis of HyPRP was performed through overexpression and RNA interference (RNAi) approaches in tomato. Transgenic plants had enhanced tolerance to various abiotic stresses (e.g, oxidative stress, dehydration, and salt). Interestingly, HyPRP-interacting proteins can detoxify sulfur dioxide (SO2) revealed in Yeast Two-Hybrid screening. These proteins include sul?te oxidase (SO), ferredoxins (Fds), and methionine sulfoxide reductase (Msr). During biosynthesis, SO and Fds catalyze the transformation of sul?tes (main component of acid rain converted by SO2 to non-toxic sulfates or hydrogen sulfides, and Msr reduces the production of ROS (reactive oxygen species). The study on how HyPRP modulate Msr A, SO, and Fds to enhance tolerance to SO2 and oxidative toxicity is very important.

番茄中的一个杂合脯氨酸富集蛋白HyPRP的氨基酸序列含有一个脯氨酸富集和一个8CM（eight-cysteine motif）结构域，它受多种非生物逆境的负向调控表达，如干旱、高盐、冷、热、氧化和脱落酸。通过超量表达和RNAi抑制表达HyPRP的转基因功能分析，我们发现抑制该基因表达后，番茄表现出较强的抗盐、抗脱水和抗氧化能力，为了进一步研究其在抗逆中的分子机理，我们以HyPRP为钓饵酵母双杂筛选番茄的cDNA 文库，发现HyPRP和二氧化硫氧化酶（SO）、铁硫蛋白（Fds）和蛋氨酸硫氧化物还原酶（Msr）互作，其中SO和Fds可分别从氧化途径和还原途径将植物体内有毒害的亚硫酸盐分别转化为没有毒害的硫酸盐和硫化氢，Msr 具有清除植物体内的超氧自由基的功能，而亚硫酸盐和超氧自由基是空气中二氧化硫污染所产生的主要毒害物质。进一步研究HyPRP在抗二氧化硫毒害中的作用具有很重要的意义。

杂合脯氨酸富集蛋白HyPRP （hybrid proline-rich protein）是植物中所特有的一类蛋白，很多研究报道表明这类基因受到生物或非生物逆境的诱导表达，但是目前为止，除了知道这类基因可能是细胞壁的结构蛋白以外，其他功能还一无所知。本项目基于在番茄中发现的一个杂合脯氨酸富集蛋白HyPRP基因超量表达后使番茄的抗逆性更加敏感，但是RNAi抑制其表达后，番茄表现出较强的抗盐、抗脱水和抗氧化能力。而且以HyPRP为钓饵酵母双杂筛选番茄的cDNA文库，发现HyPRP和二氧化硫氧化酶（SO）、铁硫蛋白（Fds）和蛋氨酸硫氧化物还原酶（Msr）互作。本项目在这些基础之上，开展了进一步的HyPRP抗逆分子机理研究。一方面，我们对HyPRP转基因植株的遗传分析和表型的进一步鉴定，确定了抑制表达HyPRP提高了番茄的抗氧化能力，并且一些抗氧化基因（如SOD，CAT和Msr B）在HyPRP-RNAi抑制系中上调表达，相反在超表达系中下调表达，这些说明了HyPRP抗氧化能力是通过调控一些抗氧化基因的表达来行使功能的。HyPRP的亚细胞定位表明，其主要定位在细胞核和细胞膜中。另一方面，我们利用BiFC（双分子荧光互补）验证了HyPRP和SO、Fds、Msr和UBQ10的互作关系，并且对这些互作蛋白进行了表达和生物信息学分析，发现其互作蛋白也是受到非生物逆境胁迫的诱导表达的，并且也有研究表明SO和Fds可分别从氧化途径和还原途径将植物体内有毒害的亚硫酸盐分别转化为没有毒害的硫酸盐和硫化氢，Msr 具有清除植物体内的超氧自由基的功能，而亚硫酸盐和超氧自由基是空气中二氧化硫污染所产生的主要毒害物质。这两个方面的基础之上，我们重点分析了HyPRP在植物抗二氧化硫中的作用，通过亚硫酸根处理实验，确定了HyPRP在植物抗二氧化硫中具有很重要的作用，检测处理前后硫酸根离子的含量，表明HyPRP抗二氧化硫的毒害可能是通过清除亚硫酸根离子和超氧自由基（ROS）来行使其功能的；通过检测二氧化硫处理前后，转基因和野生型植株中的硫代谢中的相关基因的表达，进一步说明HyPRP在植物硫代谢过程中具有非常重要的作用。这些都为后期转基因育种和分子标记辅助选择育种提高植物的抗逆性奠定了基础。