一个double B-box锌指蛋白基因OsBBX22b调控水稻光周期开花的机理研究

We identified one gene encoding double B-box zinc finger protein, OsBBX22b, during analyzing the mechanism of phytochrome-mediated photomorphogenesis. OsBBX22b overexpression lines exhibited the delayed flowering under long-day conditions, which suggest that OsBBX22b is involved in regulating photoperiodic flowering in rice. However, the mechanism by which OsBBX22b regulates photoperiodic flowering in rice remains elusive..In this project, we will explore the mechanism by which OsBBX22b regulates photoperiodic flowering in rice at cellular, physiological and molecular levels. (1) To analyze effects of light signal mediated by phytochrome, photperiod and circadian clock on OsBBX22b transcript level; (2) to analyze the subcellualr localization and putative transcriptional activity of OsBBX22b protein; (3) to culture OsBBX22b overexpression lines and RNAi lines, and analyze the relation between flowering time and length of light period in the transgenic rice; to uncover the key genes which are regulated by OsBBX22b and play important roles in photoperiodic flowering pathway. Based on this project, we will probably explore an new pathway to control photoperiodic flowering in rice. Furthermore this project also lays the foundation for comprehensive research on the roles of double B-box zinc protein in rice growth and development.

在分析水稻光敏色素调控光形态建成的机制过程中，我们鉴定到一个double B-box 锌指蛋白基因（OsBBX22b）。在长日条件下该基因过量表达转基因水稻表现为开花延迟，推测OsBBX22b参与调控水稻光周期开花。但是其调控机制仍不清楚。.本项目从细胞、生理和分子三个方面分析OsBBX22b对水稻光周期开花的影响，旨在揭示OsBBX22b调控水稻光周期开花的机制：（1）分析光敏色素介导的光信号、光周期和生物钟对OsBBX22b基因表达的影响；（2）分析OsBBX22b的亚细胞定位及可能的转录调控活性；（3）培育OsBBX22b 过表达转基因水稻和RNAi转基因水稻，分析转基因水稻开花时间与光期长度之间的关系，揭示OsBBX22b所调控的光周期开花途径上的关键基因。本项目拟阐明一条控制水稻光周期开花的新途径，并为深入研究double B-box锌指蛋白在水稻生长发育中的作用奠定必要的基础。

根据Huang等（2012）年发表的文章中的命名规则，本研究所关注的OsBBX22b更名为OsBBX14。B-box蛋白是一类包含有一个或两个B-box结构域的锌指蛋白，这类蛋白在拟南芥生长发育过程中起到重要的作用。然而迄今为止关于水稻中BBX蛋白功能的报道还非常少。在本研究中，我们鉴定到一个仅含有两个B-box结构域的水稻BBX蛋白Oryza sativa BBX14 (OsBBX14）。我们利用在线软件对该蛋白进行序列分析，利用改进的酵母单杂交技术对该蛋白进行转录激活活性分析，利用qRT-PCR技术对该基因及开花相关基因进行了表达模式分析，利用转基因技术分析了该基因的功能。OsBBX14在叶片，特别是在旗叶中大量表达。在光周期条件下以及随后的连续光照条件下，OsBBX14在转录水平上表现出明显的昼夜节律性。OsBBX14蛋白定位于细胞核中，而且至少在酵母中具有转录激活活性。我们发现OsBBX14 过表达转基因株系（OsBBX14-OX）在长日照及短日照条件下表现出延迟的抽穗期，进一步研究发现，不论是在长日照条件下还是在短日照条件下，开花素基因Hd3a和RFT1的表达水平明显下调，这与OsBBX14-OX株系表型是一致的。在长日照条件下Hd3a的负调控因子Hd1在OsBBX14-OX株系中表达上调，说明OsBBX14有可能是通过上调Hd1的表达延迟水稻抽穗的。而在短日照条件下，Ehd1在OsBBX14-OX株系中表达下调，而Hd1基因的表达并不受影响，说明在短日照条件下，OsBBX14通过抑制Ehd1的表达延迟水稻抽穗。综上所述，在长日照及短日照条件下OsBBX14通过不同的途径影响水稻抽穗。此外，我们还分析了光敏色素通过microRNA途径调控锌指蛋白家族基因的表达，暗示了microRNA 途径在调控OsBBX14基因中的作用。