MuSK在肉毒毒素A诱导代偿性神经肌接头形成中的作用机制研究

Botulinum toxin type A (BT-A) has become the preferred treatment for most kinds of focal dystonias, but the effective duration of a single injection is limited. The recession of BT-A’s effect has been reported to be related with nerve sprouting at injection site. Our previous study revealed new neuromuscular junction formation during the muscle strength recovery , which was accompanied with upregulated expression of the muscle specific tyrosine kinase (MuSK). Inhibition of the nerve sprouting caused by BT-A with different methods slowed the recovery of gastrocnemius muscle strength,which was accompanied with a reduction of new neuromuscular junction formation and less upregulation of MuSK. These results suggest that MuSK is a key point in new neuromuscular junction formation and BT-A effect recession. In this project , RNA interference technology will be used to interfere MuSK expression in individual and cellular levels. After the injection of BT-A, we will observe the formation of neuromuscular junction as well as the expressions of MuSK downstream factors. In order to clarify the molecular mechanisms of MuSK in the formation of neuromuscular junction, the role of MuSK-Rac-PAK1 pathway and MuSK-Rac-GABP pathway on acetylcholine receptor gene expression and clustering will be studied.To the results of this study will provide potential targets for intervention that can prolong the effective duration of BT-A .

肉毒毒素A（BT-A）是局限性肌张力障碍的首选治疗，但单次注射后疗效持续时间有限。既往研究提示BT-A作用衰退与注射部位代偿性神经芽生有关。我们前期研究发现腓肠肌局部注射BT-A后，肌力恢复过程中局部新生神经肌肉接头形成并伴有肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）表达上调；多种抑制神经芽生方法均可导致肌力恢复速度减慢，伴有新生神经肌肉接头形成减少及MuSK表达上调幅度减低。这些结果提示MuSK是调控代偿性神经肌肉接头形成及BT-A作用衰退的关键环节。本研究将探讨采用RNA干扰MuSK表达后，对BT-A注射后神经肌肉接头形成的影响，检测MuSK下游因子在动物及细胞水平的表达变化；通过补救实验探讨MuSK-Rac-PAK1通路和MuSK-Rac-GABP通路对乙酰胆碱受体基因表达及聚集的影响，阐明MuSK在BT-A作用后神经肌肉接头代偿性增生过程中的分子机制，为延长BT-A作用时效提供潜在干预靶点。

A型肉毒毒素A（Btx-A）是局限性肌张力障碍的首选治疗，但单次注射后疗效持续时间有限。既往研究提示Btx-A作用衰退与注射部位代偿性神经芽生有关。我们前期研究发现腓肠肌局部注射Btx-A后，肌力恢复过程中局部新生神经肌肉接头形成并伴有肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）表达上调；多种抑制神经芽生方法均可导致肌力恢复速度减慢，伴有新生神经肌肉接头形成减少及MuSK表达上调幅度减低。本研究项目主要研究Btx-A对大鼠腓肠肌肌力及神经肌肉接头（NMJ）代偿性增生的影响及其影响机制，进一步证实了Btx-A对MuSK表达的影响；通过干扰腓肠肌局部MuSK基因的表达，研究MuSK在Btx-A作用后代偿性神经肌肉接头形成及功能恢复过程中发挥作用机制。结果显示，Btx-A注射后1w，注射侧腓肠肌肌力即明显降低，注射2w后可见肌力逐渐恢复，但在恢复过程中Btx-A组肌力值均显著低于空白对照组；在肌力下降的过程中伴有Ach-R在突触后膜的聚集升高，NMJ形成的主要因子MuSK，IGF-1，Rapsyn，Wnt3a，Wnt3等基因表达水平显著上调；同时发现不同剂量Btx-A导致MuSK表达异常程度亦不相同，进一步证实了MuSK在Btx-A作用后的关键作用。另外予以AAV-MuSK-RNi干扰大鼠腓肠肌局部MuSK基因的表达，结果显示干扰MuSK表达后，Btx-A作用后第14天肌力即开始恢复，至第12W，仍低于对照组及空白病毒组。表明干扰MuSK表达后，可以抑制Btx-A作用后肌力的恢复速度，延长Btx-A的作用时间。Btx-A注射后导致局部2238个基因表达水平上调，2326个基因表达水平下调；采用RNA干扰MuSK的表达后，仅12个基因表达水平上调，25个基因表达水平下调，所改变基因涉及能量代谢、NMJ形成、肌肉萎缩及恢复等各生理过程。本研究证实了MuSK在Btx-A作用后发挥关键作用，证实干扰MuSK表达后，影响了Btx-A注射后多数基因的表达，延长Btx-A局部注射后肌力恢复时间并增强其对肌力的抑制作用，为临床增强Btx-A的作用效能提供了新的思路。