A型肉毒毒素诱导大鼠颌下腺细胞自噬的作用及机制研究

Autophagy is the basic catabolic mechanism that involves cell degradation of unnecessary or dysfunctional cellular components through the lysosomal machinery. Our previous work indicated the existence of acinar cell autophagy in botulinum toxin type A (BTXA)-treated submandibular gland. However, the mechanism involved in BTXA-modulated autophagy is not clearly demonstrated. To assess autophagy occurrence, the autolysosomes accumulation and the expression and location of autophagy related proteins will be observed. The effect of autophagy inhibitor and activator on BTXA-treated cells will be accessed in vitro. To study the role of certain protein and the precise regulation mechanisms of BTXA and autophagy in submandibular gland, RNA interference or overexpression methods will be applied to change the protein levels, chemical inhibitors or dominant-negative plasmid transfection will be used to suppress protein activity. This study may provide new clues for further research on the mechanism of BTXA inhibiting the function of salivary function, which is pivotal for the development of new clinical applications for BTXA.

自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞噬物在溶酶体内降解的过程。我们前期的工作发现A型肉毒毒素(botulinum toxin type A, BTXA)抑制颌下腺分泌伴随细胞自噬的发生，然而有关BTXA与自噬的研究国内外尚无报道。本课题拟以BTXA诱导颌下腺自噬为重点，研究BTXA诱导大鼠颌下腺内自噬体的堆积以及自噬相关蛋白表达和分布的变化，在组织水平上明确BTXA可诱导自噬；在培养的大鼠颌下腺细胞上明确BTXA能否诱导自噬以及其量效关系和时效关系，在细胞水平上探讨BTXA诱导自噬对颌下腺结构、功能和细胞凋亡的作用，明确BTXA诱导自噬的信号转导通路；通过小分子RNA干扰技术和质粒转染技术选择性敲低或过表达自噬相关基因，在分子水平上明确BTXA诱导颌下腺自噬的作用和分子机制。该研究将为BTXA作用机制的研究提供新方向，进一步扩展BTXA的临床应用范围。

课题组前期的实验证实A型肉毒毒素（Botulinum Toxin type A， BTXA）可以诱导大鼠及家兔颌下腺细胞萎缩、间质增生。国外有研究报道称，大鼠颌下腺细胞损伤和修复中常伴有自噬的发生，但BTXA诱导的腺体萎缩和间质增生是否和自噬有关不得而知。在本研究中，我们采用Western blot和免疫荧光检测大鼠颌下腺内自噬相关蛋白轻链3 (light chain 3, LC3)的表达和分布情况。采用MTS法检测BTXA对大鼠颌下腺细胞系C6 (submandibular gland cells，SMG-C6)的毒性作用。采用Realtime PCR和Western blot法检测SMG-C6细胞中LC3和SQSTM1/p62 (sequestosome 1, SQSTM1/p62)的mRNA和蛋白表达情况。采用激光共聚焦，观察自噬体标记蛋白GFP-LC3与溶酶体示踪剂LysoTracker的共定位情况，评估SMG-C6细胞自噬流的畅通情况。Western blot和免疫荧光结果显示，BTXA可以暂时性地诱导大鼠颌下腺细胞内自噬体数量的增加。当BTXA作用于大鼠颌下腺1周和2周时，腺泡内自噬体和自噬体标志蛋白LC3-II明显增多，4周时开始恢复，注射后12周和24周时接近正常对照组水平。 MTS结果显示BTXA对SMG-C6细胞的毒性作用有明显的剂量和时间依赖性。在24小时内BTXA对细胞的增殖有抑制作用，当孵育时间超过24小时，对细胞的毒性作用减弱，细胞逐渐恢复并出现生长增殖现象。 Realtime PCR结果显示，BTXA有诱导p62和LC3基因高表达的趋势，但未显示出统计学差异。Western blot结果显示BTXA可以明显增加LC3-II蛋白的表达，而p62蛋白表达未见明显差异。自噬体标记物GFP-LC3与溶酶体示踪剂LysoTracker的共定位结果显示，BTXA作用于SMG-C6细胞后，引起细胞内的自噬体数量增多，但自噬体和溶酶体的融合却出现了失共定位现象，提示BTXA干扰了自噬体与溶酶体融合。本研究对完善BTXA抑制腺体分泌的作用机制有重要的实际意义，也为BTXA的临床应用和基础研究提供新的思路。