线粒体自噬在A型肉毒毒素抑制颌下腺分泌中的作用及机制研究

Mitochondiral autophagy, which is also known as Mitophagy, refers to the degradation of damaged mitochondria caused by stimulis such as reactive oxygen species (ROS), nutritional deprivation, etc. Our previous investigations found the existence of apoptosis and autophagy as well as mitophagy of acinar cell involved in botulinum toxin type A (BTXA) treating submandibular gland (SMG). However, the mechanism of BTXA-modulated mitophagy remains unclear. In this study, we try to investigate whether mitophagy occurs to BTXA inhibiting salivary gland.To evaluate the mitophagy occurrence, (1) we first examined that the expression and location of mitophagy related protein in vivo; (2)we examined the change of mitochondrial dysfunction after the treatment of BTXA in the SMG-C6 cell lines, and we also try to investigate the expression of Parkin, Pink, NIX and FUNDC1 in vitro; (3) to investigate the mechanism of BTXA and mitophagy in SMG, RNA interference or overexpression methods will be applied to change the protein levels. This study may provide some new clues to understand the mitophagy in BTXA inhibiting the function of salivary function.

线粒体自噬（mitophagy）是指在活性氧、营养缺乏等刺激下，细胞内损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中，并与溶酶体融合，从而引起损伤线粒体的降解过程。我们的前期工作发现，A型肉毒毒素（BTXA）诱导颌下腺细胞凋亡与自噬时伴有线粒体自噬的发生，然而针对BTXA诱导细胞发生线粒体自噬的研究尚无报道。本项目以BTXA抑制颌下腺分泌为主线，以线粒体自噬为重点，探讨BTXA治疗唾液腺相关性疾病的具体作用和机制。我们拟采用：（1）以大鼠为模型，观察BTXA注射颌下腺时线粒体自噬相关蛋白表达及分布变化情况；(2)在BTXA培养的细胞上观察线粒体膜电位、ROS等变化水平，同时观察NIX,FUNDC1，Parkin，Pink等线粒体自噬相关蛋白的变化情况； (3) 通过小RNA干扰技术选择性敲低或过表达线粒体自噬相关蛋白，在分子水平上明确线粒体自噬的信号转到通路，为BTXA的临床应用提供新思路。

A型肉毒毒素（botulinum toxin type A，BTXA）是肉毒杆菌产生的一种神经毒素，大量临床研究表明BTXA可以有效治疗流涎等腺体分泌过多性疾病。唾液主要经跨细胞途径和旁细胞途径分泌，其中紧密连接是唾液经旁细胞途径转运的结构基础和限制因素。紧密连接蛋白表达的异常将会影响旁细胞途径的通透性从而影响唾液分泌。长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类不编码蛋白质的RNA，对于唾液腺疾病的发生发展具有重要影响，近年来有研究发现BTXA可以影响非编码RNA的表达，但BTXA是否会影响唾液腺的紧密连接蛋白，以及BTXA是否影响唾液腺中lncRNA的表达目前尚不清楚。在本本研究中，我们发现：① BTXA注射至大鼠下颌下腺后腺泡萎缩，刺激性唾液流率降低，乙酰胆碱酯酶表达降低，提示成功建立了BTXA抑制下颌下腺分泌的动物模型；② BTXA注射至大鼠后，紧密连接蛋白claudin-1和-3表达增加。BTXA处理SMG-C6细胞后旁细胞途径通透性减低，claudin-1、-3和-4表达增加。提示BTXA抑制唾液分泌与紧密连接蛋白表达的异常有关；③ BTXA注射至大鼠下颌下腺后与对照组相比有254个DE lncRNAs，其中上调的123个，下调的131个。DE mRNAs共有631个，其中上调的263个，下调的368个；④ 在lncRNA-mRNA共表达网络发现4个与唾液分泌相关的配对（Fancm，LOC102546383和AC094236.1-Aqp5; Fancm-Trpv6）。在ceRNA网络发现7个lncRNAs，19个mRNAs参与唾液分泌过程。本研究对完善BTXA抑制腺体分泌的作用机制有重要的实际意义，也为BTXA的临床应用和基础研究提供新的思路。