基于CRISPR/Cas9技术的纯合型家族性高胆固醇血症LDL受体基因精准治疗的基础研究

Homozygous familial hypercholesterolemia (HoFH) is a severe monogenic inherited metabolic disorder, which is associated with rapid progression of atherosclerosis. The main pathogenic gene is low density lipoprotein receptor (LDLR). At present, the effect of lipid-lowering therapy in treatment of HoFH patients is poor, and it couldn’t fundamentally correct metabolize of LDL. The recently studies showed CRISPR/Cas9 technology have already shown its potential value of gene therapy in single gene genetic disease effect. But there are no relative study in the HoFH. In the previous study, we preliminary constructed CRISPR/Cas9 knock out/repair system. We proposed that CRISPR/Cas9 can accurately repair the LDLR gene mutation, fundamentally correct the LDL metabolism. We plan to use the CRISPR/Cas9 technology to repair LDLR mutations in the immortalized lymphocytes which from HoFH patients and use the low cytometry to detect the function of LDLR. Then, use the CRISPR/Cas9 technology to construct the hamster cell line with LDLR gene mutation and to repair LDLR mutation. In addition, intravenous injection the CRISPR/Cas9 system into liver of LDLR homozygous mutant hamster, use the immunofluorescence to detect the injury of liver tissue and explore the recovery of LDLR structure and functional, and improvement of blood lipid. This project can provide new ideas for HoFH therapy.

纯合型家族性高胆固醇血症（HoFH）是严重的单基因遗传代谢病，动脉粥样硬化进展迅速，主要发病机制为低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变；目前药物等降脂治疗效果差且不能从根本上纠正LDL代谢。新近报道CRISPR/Cas9技术可修复基因突变并在单基因遗传病治疗中初显成效，但尚未见在本病研究。我们前期已建立LDLR基因的CRISPR/Cas9敲除/修复系统；提出“CRISPR/Cas9系统可精准修复LDLR基因突变，从根本上纠正LDL代谢”假说。拟以CRISPR/Cas9技术为主要手段，首先用于HoFH患者淋巴细胞LDLR基因突变位点修复，流式细胞术检测LDLR功能；其次用于建立LDLR基因突变的仓鼠细胞株，并用该系统修复；进而以腺相关病毒为载体将修复系统静脉输入ldlr-/-纯合突变仓鼠肝脏，免疫荧光检测肝组织损伤，探讨LDLR结构功能恢复及血脂改善。本项目为HoFH患者精准治疗提供新思路。

已完成自然基金青年基金课题计划的主要研究内容，并取得如下成果。.一、主要成果：.1. 首次对纯合患者来源的永生化淋巴细胞进行CRISPR/Cas9基因编辑，修正这些患者的LDLR突变位点，由于转染效果不理想，没有达到完全修复的目标，虽然未得到有效结果，但给未来研究提供一个方向，如果将来有很好的转染试剂，可以在淋巴细胞上进行基因编辑；.2. 完成对小鼠肝细胞进行LDLR的敲除实验，已获得了多个单克隆，对纯合的LDLR突变小鼠肝细胞系进行修复实验，对于机制和治疗来说提供更多的理论依据；.3. 首次通过纳米材料装载CRISPR/Cas9质粒成功敲除了小鼠肝脏PCSK9基因，到实验动物表型的变化，且不影响肝功能的改变，为将来纳米材料在基因编辑领域的应用提供了部分依据；.4. 首次采用最新的原位电转受精卵的方法（GONAD）敲除小鼠受精卵LDLR基因，NEPA21 电转染仪采用全新设计的电转程序，特别适用于难转染细胞、离体组织或动物活体的转染。配合独有的电压衰减（Voltage/Decay）设计。NEPA21可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率，且在2020年10月发表在Nature protocol上，方法可信。.后续将继续优化实验方法，建立LDLR敲除的小鼠模型，随后进行修复实验，为纯合型家族性高胆固醇血症的治疗提供依据。.二、发表论文：基于这些研究成果，已发表了2篇SCI文章以及1篇中文期刊文章，此外还有正在撰写、投稿或者返修阶段2篇文章：中国纯合FH遗传特点及临床特点的文章正在投稿阶段，小鼠肝脏敲除PCSK9基因的实验结果正在汇总整理阶段。.三、人才培养：培养博士生1人（1名已获得博士学位），硕士生2人（2名已获得硕士学位）。此外，本人目前还在美国马里兰大学进行博后深造。.四、潜在应用前景：本研究所采用的纳米材料系统可为将来FH等疾病的基因治疗提供新的方向，并有望作为延缓心血管动脉粥样硬化的关键载体。此外，新型原位电转受精卵的方法（GONAD）可极大缩短构建基因鼠模型的时间，为将来研究FH疾病机理及基因治疗提供强有力的证据支持。总之，CRISPR/Cas9技术搭配现有的新技术、新方法，在FH基因治疗的领域具有强大的应用前景。