利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现F8在小鼠肝脏中的精准整合以治疗血友病A

Hemophilia A (HA) is an inherited disorder induced by dysfunction or deficiency of the coagulation factor F8 (Factor VIII). A potential cure to HA is ectopic integration of F8 in hepatocytes.. Recently, adeno-associated virus (AAV)-based in vivo gene therapy strategies have made remarkable progress in clinical trials of hemophilia B . However, the size of F8 gene exceeds the packaging capacity of AAV, making it almost impossible for using the same approach to treat HA.Here, we propose a paradigm-shift approach that may care hemophilia A. Using our recently developed double cut pDonor vector, high-level precise integration of F8 can be achieved at the Alb locus of hepatocytes. After F8 integration, the Albumin transcription machinery will drive the high-level expression of F8, leading to normalization of F8 activity in HA mice. We will further identify immunomodulators to abrogate the development of inhibitory antibodies against F8, thereby leading to long-term sustainable serum levels of F8. This novel strategy may eventually be developed into an affordable, efficacious and safe therapy that cures HA permanently.

血友病A(HA)是凝血因子F8 (FVIII)缺乏导致的遗传性出血性疾病，治愈的根本途径是用基因编辑技术进行原位修复或异位敲入。近年来，基于腺相关病毒(AAV)载体的体内基因治疗在血友病B的研究中取得了可喜进展，为HA的基因治疗开拓了新思路，但是F8基因的编码序列大大超过了AAV的包装极限，限制了AAV在HA基因治疗中的应用。因此，我们提出一个新的利用普通质粒载体治疗血友病A的策略：基于我们课题组开发的创新型双切pDonor载体，把F8基因导入肝细胞中，精准整合至肝脏的血清白蛋白位点后，可使F8活性完全恢复正常。还将通过组学研究揭示免疫抑制剂诱导免疫耐受的机理，然后确定最优方法防治F8抑制物的产生，从而维持F8活性的长期稳定。这一策略有望开发成为治愈血友病的廉价、高效、安全的新方法。

血友病A是凝血因子F8基因突变导致的出血性基本，只有通过基因治疗才能彻底治愈。本项目利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将凝血因子F8异位表达在血友病A小鼠肝组织中的Alb位点，促进F8蛋白的高水平异位表达，从而治愈血友病A小鼠。为了更好的达到研究目的，我们也做出了多方面的尝试和努力，取得一系列研究成果。首先我们通过联合使用双切同源重组模板和减少细胞死亡大幅度提高CRISPR-Cas9基因编辑效率，为后续血友病A小鼠体内基因治疗奠定基础；其次我们通过NHEJ介导的异位F8插入治愈血友病A小鼠；接下来为进一步提高基因编辑效率，我们建立了HDAC抑制剂提高基因编辑效率的技术方法，并且首次揭示CRISPR-Cas9基因编辑动力学修复机制；最后建立了基因编辑后大片段删除突变的质控方法，为促进基因编辑策略进行临床转化保驾护航。本项目实现了最初的研究目的，并且取得更深入的研究成果，为我国基因治疗事业的发展做出一定贡献。