DFO通过HIF-1α影响CXCR4阳性牙髓细胞修复能力的研究

According to the preliminary findings and literature review，we draw the following hypothesis:1. The CXCR4 positive pulp cells (CXCR4+ DPCs) may be stem/precursor cells in the formation of reparative dentin; 2.Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) may be an important initiation factor for repair reaction after injury of dental pulp; 3. Deferoxamine (DFO) may be able to stimulate DPCs produce HIF-1α and it result in expression of related downstream target genes, which enhance the repair function of CXCR4+ DPCs by paracrine. In order to prove the above hypothesis, we silence DPCs HIF-1α gene by shRNA. In the meantime, we co-cultured CXCR4+ DPCs with DPCs treated by DFO in the pre/post silence of HIF-1α gene. Finally, we will observe the repair capacity of CXCR4+ DPCs including proliferation, migration, adhesion and odontoblast differentiation. Our research can further improve dental pulp stem cells repair theory and provide theoretical support for the development of a new pulp capping agent in clinic.

根据前期的研究结果及文献复习，我们得出如下假设：1. CXCR4阳性牙髓细胞（CXCR4+ DPCs）可能是牙髓在形成修复性牙本质过程中起重要作用的干/前体细胞；2. 低氧诱导因子-1α（HIF-1α）可能是牙髓损伤后启动牙髓修复反应的重要启动因子；3. 去铁胺（DFO）或许能够刺激DPCs产生HIF-1α，促进下游相关靶基因的表达并通过旁分泌作用于CXCR4+ DPCs，从而提高牙髓组织的修复功能。为验证上述假设，我们拟通过DFO作用DPCs后与CXCR4+ DPC共培养，结合RNA干扰技术，从细胞增殖，迁移、黏附及成牙本质分化四个方面来考察DFO通过HIF-1α对CXCR4+ DPCs修复能力的影响。从而可以进一步完善牙髓干细胞修复理论，并为临床开发新型盖髓剂提供理论支持。

目的：根据前期的研究结果及文献复习，我们得出如下假设：1. CXCR4阳性牙髓细胞（CXCR4+ DPCs）可能是牙髓在形成修复性牙本质过程中起重要作用的干/前体细胞；2. 低氧诱导因子-1α（HIF-1α）可能是牙髓损伤后启动牙髓修复反应的重要启动因子；3. 去铁胺（DFO）或许能够刺激DPCs产生HIF-1α，促进下游相关靶基因的表达并通过旁分泌作用于CXCR4+ DPC，从而提高牙髓组织的修复功能。为验证上述假设，我们进行本课题研究。材料和方法:1.不同浓度DFO作用CXCR4+ DPCs不同时间后，从对细胞活性、增殖及迁移等几个方面的影响挑选出DFO的最佳作用浓度及时间。2.以腺病毒作为载体，构建HIF-1α shRNA（pAd/pENTR/shRNA-/GFP-HIF-1α），转染CXCR4+ DPCs并进行验证。3.体外观察DFO作用HIF-1α基因沉默前/后CXCR4+ DPCs成牙本质分化能力的变化。4.观察DFO预处理HIF-1α基因沉默前/后CXCR4+ DPCs在体内形成牙本质样组织的情况。结果:1.10µM DFO处理CXCR4+ DPCs 48h，可促进其增殖和横向迁移，并能提高其HIF-1α的表达，但是对其细胞活性和趋化作用的影响不明显。2.HIF-1α干扰腺病毒（pAd/pENTR/shRNA-/GFP-HIF-1α）在mRNA水平的干HIF-1α的表达，并在蛋白水平成功阻断了DFO促进CXCR4+ DPCs HIF-1α的表达效果。3.10µM DFO处理CXCR4+ DPCs 48h，可以在体外促进其成牙本质分化。几个与成牙本质分化相关的基因被上调。沉默HIF-1α基因后，DFO成牙本质分化的促进作用将被消除。4.体内实验结果显示10µM DFO预处理CXCR4+ DPC 48h后，可在体内形成更多的牙本质样组织，沉默HIF-1α基因后，CXCR4+ DPCs几乎不能形成牙本质样组织。结论:1.DFO处理CXCR4+ DPCs的最佳作用浓度为10M，最佳处理时间为48h。2.成功构建HIF-1α干扰腺病毒（pAd/pENTR/shRNA-/GFP-HIF-1α)。3.DFO可以在体外和体内促进CXCR4+ DPCs成牙本质分化，沉默HIF-1α基因后，DFO成牙本质分化的促进作用将被消除。