稻曲菌素纳米磁珠酶联免疫检测方法建立及应用

Rice false smut is a kind of emerging and increasingly significant disease which is caused by the pathogenic fungus Villosiclava virens (anamorph: Ustilaginoidea virens) in most rice producing countries. So far, six kinds of ustiloxins have been isolated from the rice false smut balls. The toxins can not only inhibit the growth of rice, wheat and corn, but also poisoned people and animals. Immunoassays have been widely used in food security field for it is suitable for rapid test. As the available immunoassays and products are only aimed at single ustiloxin and it is hard to meet the current requirement of simultaneous rapid screening of multiple toxins, it is urgent to develop the general rapid detection technology. Generic hapten for ustiloxins will be synthesized and conjugated with protein to produce generic immunogen which will be then injected into rabbits to generate generic antiserum. The magnetic bead-antibody complex will be prepared by immobilization the general antibody on the surface of magnetic beads . With the magnetic bead-antibody complex, an improved ELISA method for the rapid detection of several ustiloxins will be established and could be applied for multi-residue detection of this kind of toxins. The research will provide technical support for food production safety in China, which has great theoretical and practical significance.

稻曲病由稻绿核菌引起，是我国水稻生产中的重要病害之一。前人研究表明：稻曲病菌侵染形成的稻曲球中含有6种稻曲菌素，这些毒素对人及其它动物的健康有较大危害。目前稻曲菌素检测主要采用液相色谱-质谱联用法，存在价格昂贵、操作复杂等问题。免疫检测技术因适合现场快速检测已广泛应用于粮食安全领域，针对稻曲菌素的免疫检测技术研究已有报道，但现有技术产品只针对单一稻曲菌素，难以满足当前对多种毒素同步快速检测的需求，迫切需要发展稻曲菌素通用免疫快速检测技术。本项目拟设计合成稻曲菌素通用半抗原，通过结合载体蛋白质制备通用人工抗原，免疫动物获得抗多种稻曲菌素的群特异性抗血清；合成纳米磁珠并进行表面修饰，制备纳米磁珠-抗体复合物；在此基础上建立可同步快速检测多种稻曲菌素的酶联免疫检测方法并进行应用。研究成果将为保障我国粮食生产安全提供技术支持。

稻曲病由稻绿核菌引起，是我国水稻生产中的重要病害之一。前人研究表明稻曲菌侵染水稻后形成的稻曲球中含有6种稻曲菌素，这些毒素对生物具有毒害作用。目前稻曲菌素检测主要采用液相色谱、液相色谱-质谱联用法，这两种方法均存在价格昂贵、操作复杂等问题。免疫检测技术因适合现场快速检测已广泛应用于食品安全领域，但现有的免疫检测技术仅针对单一稻曲菌素，难以满足对多种毒素同步快速检测的需求。本研究设计并合成了一种基于稻曲菌素G的稻曲菌素通用抗原，免疫动物获得抗多种稻曲菌素的群特异性抗血清，建立稻曲菌素的通用抗体酶联免疫检测方法，并在此基础上以纳米磁珠为载体，建立更为高效的纳米磁珠-酶联免疫检测方法。主要研究结果如下：. （1）采用碳二亚胺法（EDC法）将稻曲菌素G与BSA蛋白直接偶联，获得了一种新型抗原USTG-BSA，并以此方法偶联获得了包被原UST-OVA，免疫小鼠后制得的通用抗体血清效价约为1:8000；通过优化确定通用抗体酶联免疫法条件为：抗体工作浓度：2 μg/mL；包被原工作浓度：2.5 μg/ml ；封闭液类型为5%的BSA溶液，封闭时间为4℃隔夜；抗体反应时间为37℃ 1 h；二抗工作时间为37℃ 30 min，显色时间为37℃ 7.5 min。通用抗体的特异性测定结果表明，稻曲菌素A、B、G对通用抗体的半抑制浓度（IC50）分别为530.66、344.54、63.26 ng/mL，交叉反应率分别为11.9%、18.4%、100%，表明通用抗体对稻曲菌素类具有特异性识别能力；此外还对4种可能产生基质效应的真菌毒素进行了检测，交叉反应率均低于1%，表明其它类型真菌毒素不会对此方法产生干扰。. （2）采用戊二醛法将表面含大量的NHS基团的免疫磁珠与稻曲菌素通用抗体结合，制备了纳米磁珠-抗体复合物，纳米磁珠最佳的活化时长为4 h，活化缓冲液的最佳pH值为7.4。在所获得纳米磁珠-抗体复合物的基础上，建立了稻曲菌素纳米磁珠酶联免疫检测方法并对方法进行了优化，得到最佳酶联免疫条件：抗体反应时间为30 min，二抗反应条件为45 min。该方法表现出强特异性和高灵敏度，稻曲菌素A、B、G对纳米磁珠-抗体复合物的半抑制浓度（IC50）分别为148.51、139.60、40.64 ng/mL，交叉反应率分别为27.4%、29.1%、100%。